[發明專利]廢水生物處理反應器中微生物群落組成的快速分子檢測方法

有效

• 申請號: 200910028319.4
• 申請日: 2009-01-13
• 公開（公告）號: CN101475987A
• 公開（公告）日: 2009-07-08
• 發明（設計）人: 任洪強;符波;丁麗麗;梁睿;廖瀟逸
• 申請（專利權）人: 南京大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C02F3/34
• 代理公司: 南京天翼專利代理有限責任公司
• 代理人: 湯志武;王鵬翔

1.一種廢水生物處理反應器中微生物群落組成的快速分子檢測方法，其特征在于， 具體步驟如下：

①收集廢水生物處理反應器中微生物樣品進行預處理，利用苯酚-氯仿法提取基因 組總DNA；

②使用16S?rDNAV3區引物341F-GC和518R、344F-GC和518R對樣品DNA進行PCR 擴增；

③利用變性梯度凝膠電泳即DGGE技術分析PCR擴增產物；

④得到的DGGE圖譜利用Quantity?one軟件分析，并根據切膠測序特征DGGE條帶， 對所代表的微生物進行鑒定；

⑤根據條帶所代表的微生物種類來設計構建變性梯度凝膠電泳數據庫DGGE Marker作為快速分子檢測的對照標準；所述變性梯度凝膠電泳集合庫DGGE?Marker是 根據PCR產物經變性梯度凝膠電泳DGGE分離后的條帶通過切膠克隆測序然后在 Genbank中同源比對明確其代表的微生物種類來設計構建的；直接采用已知條帶的PCR 產物混合或者將已知條帶所對應的純培養物DNA進行PCR擴增產物混合，從而作為 快速分子檢測方法的對照標準；所述生物樣品為廢水生物處理反應器中活性污泥；包 括厭氧顆粒污泥、好氧顆粒污泥和生物膜樣品，且經過冷凍干燥和液氮研磨的預處理， 再提取基因組總DNA；上述步驟①、②中，所述DNA由細菌和古菌的16S?rDNA?V3 區片段設計正向引物5′連接至GC-夾板進行PCR擴增；所述16S?rDNA?V3區片段進行 PCR擴增條件為94℃預變性5min，然后94℃變性30S，65℃退火30S，72℃延伸1min 共30個循環，最后72℃延伸10min；利用變性梯度凝膠電泳DGGE分析所述PCR擴 增產物的條件為：制備隨變性劑尿素濃度梯度45%-70%，同時增加丙烯酰胺凝膠濃度 梯度8%-10%形成雙梯度-變性梯度凝膠電泳DG-DGGE，電泳電壓80V，電泳時間15h， 二溴乙錠染色20min，脫色20min；

步驟①中，DNA提取的步驟是：微生物樣品經溶菌酶處理和SDS裂解：將50mg 研缽加入液氮研磨直至粉末狀沉淀懸浮在1.5ml?0.1M?Tris-HCl，0.1M?Na₂EDTA，0.1M? NaCl構成的DNA提取液、pH8，并加入10mg/ml的150μL溶菌酶溶液；37℃溫浴 1h后，向菌液中加入0.5ml?10%SDS溶液，并漩渦振蕩搖勻，65℃溫浴30min，每 間隔幾分鐘搖勻，待菌液變清后離心10min，得到DNA上清液并取DNA上清液置于 冰上留用；重復以上步驟一次，收集所述兩步驟得到的DNA上清液；用等體積的苯酚 +氯仿+異戊醇、體積比為25:24:1和氯仿+異戊醇、體積比為24:1各抽提1次，離心并 空氣干燥至DNA沉淀干燥后，溶于100μL?TE緩沖液中。