[發明專利]組織型纖溶酶原激活物環餅結構-2對腦卒中的治療作用及制備方法

無效

• 申請號: 200910027920.1
• 申請日: 2009-05-13
• 公開（公告）號: CN101886066A
• 公開（公告）日: 2010-11-17
• 發明（設計）人: 劉建寧;張菁;張海濤
• 申請（專利權）人: 南京大學
• 主分類號: C12N9/68
• 分類號: C12N9/68;C12N15/63;G09B23/28;C12Q1/37;C12Q1/02;A61K38/49;A61P25/00;A61P25/28;A61P7/02;A61P9/10
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技術領域

本發明涉及醫藥生物工程技術領域。

背景技術

組織型纖溶酶原激活物(tissue-type?plasminogen?activator，tPA)是一種絲氨酸蛋白酶。tPA具有缺血腦保護作用^1，2，但由于絲氨酸蛋白酶結構域會增大缺血腦損傷，因此不宜直接用作腦保護藥物。我們制備了一系列含有tPA不同結構域的變體，首次發現tPA分子中環餅結構2(Kringle2)結構域具有比tPA更強缺血腦保護作用，并將其用于急性腦卒中的治療。環餅結構又叫“Kringle”，包含大約90個氨基酸和3個二硫鍵，是廣泛存在于脊椎動物plasminogen-prothrombin家族酶中的結構域，主要作用是介導分子之間的相互識別，如人的APOA含有38個kringle結構。tPA?kringle2主要功能是與纖維蛋白、纖溶酶及肝素上的賴氨酸或精氨酸結合，晶體結構顯示62位和72位的Trp介導了這種作用³。tPA在缺血性腦損傷中可以作為神經遞質，拮抗Zn²⁺在局灶性腦缺血時引起的毒性作用，參與了腦缺血神經元保護作用⁴。腦缺血以后，tPA能夠調節微循環，提高缺血后的腦血流⁵。腦缺血時tPA酶切活化latent-PDGF-CC，通過星形膠質細胞上的PDGF-R受體，調節BBB開放。腦中tPA可同時在神經元細胞和神經膠質細胞中表達。生理條件下，tPA具有細胞因子樣作用，參與突觸生長、神經元細胞遷移、軸突生長以及活化BDNF參與LTP(long-term?potentiation)等作用；病理狀態下，如癲癇，可作為立即早期基因被誘導^6，7。用于臨床的r-tPA(alteplase)主要為單鏈形式(大約占70％)，tPA雙鏈形式為一條帶有氨基端的A鏈(1～275殘基)通過一個二硫鍵連接于帶有羧基端的B鏈(276～527殘基)。tPA有5種不同的結構域，A鏈由鋅指(F)結構域、生長因子(G)結構域和兩個“環餅結構”區(Kringle1，Kringle2)組成；B鏈為一個絲氨酸蛋白酶區(P)。雖然tPA有缺血腦保護作用，但tPA不宜夠直接用作腦保護藥物。因為tPA得絲氨酸蛋白酶結構域(P)會增大缺血腦損傷。早期有人使用蛋絲氨酸蛋白酶切位點突變的S478A-tPA，證實tPA腦保護作用與蛋白水解酶活性無關²。Tsirka⁸的早期研究發現，tPA通過蛋白水解酶活性降解神經元細胞外基質laminin-10(α5-β1-γ1)，引起細胞損傷^9，10。Reteplase只含有Kringle2和P兩個結構域，缺血后15分鐘注射會產生腦保護作用。alteplase比reteplase多了一個介導腦損傷的結構域(F，活化小膠質細胞¹¹)。缺血前注射tPA不會改變BBB的開放，可能是由于tPA作為神經遞質，在腦中被快速清除。tPA可以通過非蛋白酶活性活化小膠質細胞，降低TNF-α的釋放，發揮腦保護作用¹¹。目前，還沒有治療缺血性腦卒中的腦保護藥物獲得美國FDA批準。我們首次發現kringle2在腦卒中早期具有腦保護作用，為腦卒中的治療提供了新的備選藥物。

發明內容

組織型纖溶酶原激活物環餅結構-2多肽(kringle2)，作為用于腦卒中治療，以及腦損傷，神經退行性病治療的備選新藥。

具體實施方式

1.儀器與材料