[發明專利]組織型纖溶酶原激活物環餅結構-2對腦卒中的治療作用及制備方法

無效

• 申請號: 200910027920.1
• 申請日: 2009-05-13
• 公開（公告）號: CN101886066A
• 公開（公告）日: 2010-11-17
• 發明（設計）人: 劉建寧;張菁;張海濤
• 申請（專利權）人: 南京大學
• 主分類號: C12N9/68
• 分類號: C12N9/68;C12N15/63;G09B23/28;C12Q1/37;C12Q1/02;A61K38/49;A61P25/00;A61P25/28;A61P7/02;A61P9/10
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1.環餅結構-2多肽(Kringle2)制備方法在于：

2mg/mL?reteplase與2μg/mL人源plasminogen在digest?buffer(100mmol/L?PBS，0.7mol/LArg，pH8.0)中37℃酶切過夜。反應混合物在室溫用β-巰基乙醇(5mmol/L)限制性還原2小時，然后用H₂O₂(0.1mmol/L)室溫氧化1小時，破壞kringle2結構域與P結構域之間的二硫鍵。用lysine-Sepharose?4B?column進一步純化Kringle2多肽。所得Kringle2多肽對100mMPBS透析。SDS-PAGE電泳檢驗蛋白純度。腦缺血后腦室注射kringle2用于腦缺血后腦保護。

2.根據1所述方法，其特征在于reteplase作為原料，alteplase：plasminogen濃度比為1∶200～1∶5000。

3.根據1所述的方法，其特征在于反應混合物反應混合物在室溫用β-巰基乙醇限制性還原，濃度為1～20mmol/L，時間0.5～24小時。然后用H₂O₂室溫氧化，濃度為0.01～1mmol/L，時間為0.5～24小時。

4.根據1所述的方法，其特征為lysine-Sepharose?4B?column純化Kringle2。

5.PET-29a-K的構建，目的基因來自本所構建載體，上游引物5’端引物序列：5’-ggaatt?cca?tat?gtg?cta?tga?ggg?gaa?tg-3’下游引物序列5’-ccg?ctc?gag?gca?gtc?atg?cac?cat?gc-3’.。

6.根據5所述的方法，其特征為5’-gga?att?cca?tat?gtg?cta?tga?ggg?gaa?tg-3’下游引物序列5’-ccg?ctc?gag?gca?gtc?atg?cac?cat?gc-3。

7.環餅結構-2活性檢測用大鼠模型為：

大鼠大腦中動脈栓塞(middle?cerebral?artery?occlusion，MCAO)模型參照Zea?Longa等¹²，13于1989年報道的方法加以改進。SD(Sprague?Dawley)大鼠，雄性，280～320g。頸外動脈分離完畢后，將直徑0.16mm釣魚線從切口插入，將釣魚線和血管輕輕用手術線結扎，將頸外動脈于切口處剪斷。打開頸總動脈及頸內動脈的動脈夾，將釣魚線輕輕送入頸總動脈，再回抽至頸內動脈分叉處，使頸外動脈與頸內動脈成一直線，順勢將釣魚線送入頸內動脈顱內段，至Willian’s環再回抽1～2mm，釣魚線插入深度由分叉部開始18.5±0.5mm，并開始計時。扎緊頸外動脈處手術線，縫合皮膚，釣魚線的末端留在皮膚外。大鼠的直腸溫度要保持在36.5～37.5℃之間。正常對照組不做任何處理，假手術組大鼠只切開皮膚，分離暴露血管后消毒縫皮。缺血2小時后將留在皮膚外的釣魚線從頸內動脈抽出。腦梗死體積血使用TTC染色。腦屏障完整性采用依文氏藍染色熒光檢測法測定。內源tPA使用casein-zymography檢測。

8.根據5所述的方法，其特征為SD(Sprague?Dawley)大鼠，雄性，280～320g。環餅結構-2引起腦梗死體積下降，BBB通透性下降，內源tPA活性下降。