[發明專利]一種基于體內同源重組構建酵母整合型基因突變文庫的方法

有效

• 申請號: 200910027625.6
• 申請日: 2009-05-15
• 公開（公告）號: CN101550605A
• 公開（公告）日: 2009-10-07
• 發明（設計）人: 喻曉蔚;徐巖;王睿
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C12N15/81;C12N15/90;C12R1/84
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所
• 代理人: 時旭丹;劉品超

1.一種構建酵母整合型基因突變文庫的方法，其特征是基于體內同源重組， 步驟為：

(1)將需要突變的目標基因克隆到整合型表達載體的P_AOX1啟動子控制下 的多克隆位點中構建成重組表達質粒，并將重組表達質粒導入酵母進行整合型 表達；

(2)以重組表達質粒為模板，使用引物進行易錯PCR擴增得到上下游與 表達載體各有20～70bp同源序列的突變基因；

(3)對表達載體的兩個區域：①與突變基因兩端同源區域，②與酵母基因 組AOX1區基因同源區域，進行酶切線性化；

(4)將線性化表達載體與易錯PCR擴增產物按摩爾比1∶5比例混合，將 混合物電轉化宿主畢赤酵母GS115，由于易錯PCR擴增產物兩端與線性化后的 表達載體兩端具有同源區域，兩端同源重組形成線型產物；由于線型產物兩端 具有與酵母基因組同源區域，根據同源區域的末端不同，外源目標基因片段雙 交換整合入酵母基因組中，涂布酵母篩選平板，獲得基因突變文庫。

2.根據權利要求1所述的構建酵母整合型基因突變文庫的方法，其特征在 于，步驟(1)中所述的整合型表達載體為pPIC9K、pPIC3.5K、pPIC9、pPIC3.5 或pAO815。