[發明專利]一種基于體內同源重組構建酵母整合型基因突變文庫的方法

有效

• 申請號: 200910027625.6
• 申請日: 2009-05-15
• 公開（公告）號: CN101550605A
• 公開（公告）日: 2009-10-07
• 發明（設計）人: 喻曉蔚;徐巖;王睿
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C12N15/81;C12N15/90;C12R1/84
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術領域

一種基于體內同源重組構建酵母整合型基因突變文庫的方法，涉及一種通 過同源重組構建基因突變文庫的方法。屬于蛋白質工程，分子生物學技術，基 因工程領域。

背景技術

酶的體外定向進化，屬于蛋白質的非合理設計，它不需事先了解酶的空間 結構和催化機制，通過人為地創造特殊的條件，模擬自然進化機制(隨機突變、 重組和自然選擇)，在體外改造酶基因，并定向選擇出所需性質的突變酶。酶 的體外定向進化技術極大地拓展了蛋白質工程學的研究和應用范圍，特別是能 夠解決合理設計所不能解決的問題，為酶的結構與功能研究開辟了嶄新的途徑， 并且正在工業、農業和醫藥等領域逐漸顯示其生命力。

酵母是表達外源基因的最重要的表達系統之一。酵母作為單細胞生物，在 生產和操作上具有細菌表達系統易于大規模擴增的特點，又具有真核細胞對蛋 白質的翻譯后加工及修飾的作用。酵母表達系統的表達載體主要分為兩種，即 整合型載體和附加型載體。整合型載體不含自主復制序列，轉化入酵母后整合 到酵母宿主菌的染色體上，具有穩定性好的優點，尤其適合于工業化生產。而 附加型載體能夠在酵母體內自主復制，達到較高的拷貝數，但是在非選擇條件 下多不穩定。

易錯PCR是在體外隨機引入基因突變的一種基本方法，其原理是在PCR 過程中加入高濃度的Mg²⁺和Mn²⁺，利用不平衡的dNTP(脫氧核苷三磷酸)，以 提高Taq酶在PCR擴增過程中隨機引入突變的概率(Kammann?et?al.，Nucleic Acids?Res.1989，17(13)：5404)。傳統易錯PCR構建酵母外源基因整合型突變文 庫的步驟一般包括：以目的基因作為模板進行易錯PCR，得到含有隨機突變的 擴增片段；用限制性內切酶對擴增片段和表達載體進行處理；用DNA連接酶將 二者連接；將重組表達載體導入大腸桿菌；培養大腸桿菌，大量擴增表達質粒； 提取質粒進行酶切線性化；轉化酵母，最終獲得帶有各種不同突變基因的重組 細胞，即基因突變文庫。這個過程步驟繁瑣、效率低、耗時耗力，極大的損失 了突變基因的容量，而基因突變文庫需要從成千上萬個轉化子中才能篩選到目 的轉化子，因此傳統方法不能滿足構建酵母整合型基因突變文庫的需要。

發明內容

本發明的目的是提供一種快速高效的基于體內同源重組構建酵母整合型基 因突變文庫的方法。

本發明的技術方案：一種構建酵母整合型基因突變文庫的方法，基于體內 同源重組，其步驟為：

(1)將需要突變的目標基因克隆到表達載體的多克隆位點中構建成重組表 達質粒，并將重組表達質粒導入酵母進行整合性表達；

(2)以重組表達質粒為模板，使用長引物進行易錯PCR擴增得到上下游 與表達載體有20～70bp同源序列的突變基因；

(3)對表達載體的兩個區域：①與突變基因兩端同源區域，②與酵母基因 組同源區域，進行酶切線性化；

(4)將線性化表達載體按照一定的比例與易錯PCR擴增產物混合，將混 合物電轉化酵母，由于易錯PCR擴增產物兩端與線性化后的表達載體兩端具有 同源區域，兩端同源重組形成線型產物；由于線型產物兩端具有與酵母基因組 同源區域，根據同源區域的末端不同，外源目標基因片段插入或者雙交換整合 入酵母基因組中，涂布酵母篩選平板，獲得基因突變文庫。

步驟(1)中所述的表達載體為整合型載體pPIC9K、pPIC3.5K、pPIC9、 pPIC3.5、或pAO815。

構建基因突變文庫的優選酵母宿主菌為巴斯德畢赤酵母GS115或巴斯德畢 赤酵母KM71。

本發明的原理如圖1所示，以宿主菌巴斯德畢赤酵母GS115、整合型表達 載體pPIC9K為例，外源基因用gene表示。

(1)以重組表達質粒pPIC9K-gene為模板，易錯PCR擴增得到上下游與 表達載體有20～70bp同源區段a和b的突變基因；

(2)對表達載體pPIC9K酶切線性化：分為兩步，一是酶切表達載體的需 插入外源片段處的酶切位點，二是酶切整合入酵母基因組的同源區段；