[發(fā)明專利]基于信號組合編碼的DNA連接測序方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910026892.1
• 申請日: 2009-06-03
• 公開（公告）號: CN101570784A
• 公開（公告）日: 2009-11-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 涂景;陸祖宏;白云飛;葛芹玉;孫蓓麗
• 申請（專利權(quán)）人: 東南大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 南京君陶專利商標(biāo)代理有限公司
• 代理人: 奚勝元

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明基于信號組合編碼的DNA連接測序方法涉及一種采用信號組合編碼的DNA連接 測序方法，是一種實現(xiàn)DNA序列分析的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

技術(shù)背景

隨著基因組研究的深入，特別是人類基因組計劃和各種模式生物基因組計劃的完成，生 物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)研究方式產(chǎn)生了巨大變革。從基因水平上認識生命的差異，疾病發(fā)生、發(fā)展 的規(guī)律，藥物與生命體的相互作用，不同物種之間的遺傳差異以及同一物種內(nèi)部不同個體間 的遺傳差異成為可能。盡管導(dǎo)致疾病發(fā)生的因素眾多，但基因序列差異(包括單核苷酸多態(tài) 性、DNA甲基化等)被廣泛認為是一個重要的內(nèi)在因素。多數(shù)復(fù)雜疾病發(fā)生和發(fā)展，如癌癥、 糖尿病、心血管疾病、精神疾病等，是眾多基因和環(huán)境共同作用的結(jié)果。通過對某一特定疾 病大量基因組樣本中基因突變的大規(guī)模檢測及與非患病對照基因組樣本的比對，即可獲得與 該疾病有關(guān)的基因型信息，通過隨后對藥物敏感基因突變位點的篩查，可以獲得對臨床治療 與用藥具有指導(dǎo)性意義的信息。無論是親緣關(guān)系較近的物種之間遺傳差異，還是同一物種內(nèi) 部不同個體之間的遺傳差異，都主要是以基因序列差異的形式體現(xiàn)出來。因此，如何快速的 篩查基因組中的基因序列差異成為后基因組時代的主要課題之一。

現(xiàn)有的基因序列差異的檢測方法主要為：傳統(tǒng)Sanger?DNA測序法、限制性酶切長度多 態(tài)性、單鏈構(gòu)象多態(tài)性和基于基因芯片的寡核苷酸探針雜交法等。在這些方法中，僅有傳統(tǒng) 的Sanger?DNA測序法能完成對目標(biāo)片段的全方位序列測定，其余方法均只能確定很少的一 部分序列信息。但傳統(tǒng)的Sanger?DNA測序法存在通量低、成本高、耗時長等不足。第一個 人類基因組序列測定的費用大約為10億美元。盡管這一費用目前已經(jīng)降低到2000萬美元， 但依然是制約功能基因組研究的瓶頸，大幅度降低DNA測序的成本將會大大推動生命科學(xué) 的發(fā)展。為此，美國Venter基金會在2003年提出了1000美元人類全基因組測序的研究目標(biāo)。 2004年初，美國國立衛(wèi)生院投入4千多萬美元支持DNA測序新技術(shù)的研究計劃，累計已經(jīng) 超過1億美元。其目標(biāo)是發(fā)展10萬美元的人類全基因組DNA測序技術(shù)，并最終減低為1000 美元。

目前，除對現(xiàn)有的基于電泳的測序技術(shù)的改進外，正在研發(fā)的測序技術(shù)總體上可以分為 四類。第一類是延伸測序法，將信號標(biāo)記的堿基加入到正在發(fā)生聚合反應(yīng)的DNA鏈中進行 檢測，第二類是連接測序法，將信號標(biāo)記的寡核苷酸片段加入到正在發(fā)生連接反應(yīng)的DNA 鏈中進行檢測；第三類是雜交測序法，通過制備一組高密度寡核苷酸微陣列芯片的雜交信號， 進行目標(biāo)基因的序列鑒定；第四類是分子影像等一系列可以在單分子的水平上進行測序的技 術(shù)；最后一類技術(shù)是誘導(dǎo)DNA分子蜿蜒通過非常細微的小孔，在這個過程中借助電子學(xué)或 者光學(xué)的方法對堿基進行讀出，也成為納米孔道測序技術(shù)。目前只有延伸測序方法和連接測 序方法用于全基因組測序，并且開發(fā)出了商品化的儀器和試劑，大大提高了DNA測序的效 率，大幅度降低了DNA測序的成本。然而，目前新一代的DNA測序在測序成本、通量和速 度等方面仍然不能滿足生命科學(xué)研究的需要。主要原因之一是在檢測核酸的信號標(biāo)記方法單 一、效率不高。例如，在DNA連接測序方法中，受標(biāo)記物(如熒光基團)種類的限制，每 次連接反應(yīng)一般僅能確定一個堿基的信息，如需在一次連接反應(yīng)確定兩個及兩個以上堿基信 息，則需要的標(biāo)記物種類呈現(xiàn)指數(shù)增長。因此，有效提高核酸的信號標(biāo)記方法，將會大幅度 提高DNA測序的速度、減低試劑成本。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的就是針對現(xiàn)有DNA的連接測序技術(shù)在檢測核酸的信號標(biāo)記方法單一、效 率不高，試圖通過不同標(biāo)記物狀態(tài)的組合進行二維或多維的編碼，合成信號編碼的DNA測 序探針，從而實現(xiàn)使用相同數(shù)量的標(biāo)記物檢測較多堿基或堿基組合的目的，建立快速、準(zhǔn)確、 低成本和高通量的序列測定方法。