[發明專利]基于信號組合編碼的DNA連接測序方法

有效

• 申請號: 200910026892.1
• 申請日: 2009-06-03
• 公開（公告）號: CN101570784A
• 公開（公告）日: 2009-11-04
• 發明（設計）人: 涂景;陸祖宏;白云飛;葛芹玉;孫蓓麗
• 申請（專利權）人: 東南大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 南京君陶專利商標代理有限公司
• 代理人: 奚勝元

1.一種基于信號組合編碼的DNA連接測序方法，其特征在于針對某一種特定的DNA測序 探針，利用多種標記物狀態的組合進行標記，對于一批DNA測序探針，采用多種標記物 狀態的組合進行二維或多維編碼標記，制備一套信號組合編碼的DNA測序探針，從而實 現在檢測時對不同DNA測序探針的區分和鑒別；所述標記物的狀態，包括標記物“有信 號”、“無信號”兩種狀態，以及標記物不同信號強度比例的狀態：

A??一套信號組合編碼的DNA測序探針的制備：首先制備未標記的DNA測序探針，每 一種未標記的DNA測序探針由一個或多個測序堿基、一個或多個簡并堿基N或非嚴 格配對堿基組成；測序堿基用于通過堿基互補配對法則測定待測DNA中相應位置的 堿基信息，簡并堿基N為A、T、C、G四種堿基中的任意一個；完成未標記的DNA 測序探針的制備后，針對每一種未標記的DNA測序探針，采用多種標記物狀態的基 于二維或多維編碼的一種組合進行標記，每種標記物在該DNA測序探針上標記與否 及標記的量由該標記物在狀態的組合中所對應的狀態決定；采用不同的狀態組合方案 對不同的未標記DNA測序探針進行標記，完成一套信號組合編碼的DNA測序探針 的制備；

B??利用上述一套信號組合編碼的DNA測序探針的測序流程如下：

a.選取一條測序引物與待測的DNA模板依據堿基互補配對原理進行雜交；

b.向反應體系中加入上述的一套信號組合編碼的DNA測序探針和DNA連接酶及其 反應體系，進行DNA連接反應；

c.完成DNA連接反應后，檢測全部參與狀態組合的標記物的信號，判讀每種標記 物信號所處的狀態，根據全部標記物狀態的組合情況，確定發生連接反應的DNA 測序探針的種類，從而確定該測序探針上測序堿基的類型和排布，并最終確定被 測DNA模板上對應位置的堿基或堿基序列信息；

d.完成對標記物信號的檢測后，移除DNA測序探針上的標記物；

e.重復上述步驟b-d直至DNA測序探針達到或超出待測DNA模板待測區域末端；

f.該測序引物與待測DNA模板變性分離，選取第二條測序引物；

g.重復上述步驟a-f，直至全部未知DNA模板的待測區域的全部序列信息得以確定。

2.根據權利要求1所述的一種基于信號組合編碼的DNA連接測序方法，其特征在于所述的 多種標記物對未標記DNA測序探針進行組合標記，其方案是對同一DNA測序探針分子 同時標記一種或多種標記物，或者分別用不同的標記物標記同一種DNA測序探針的不同 分子，隨后將上述不同測序探針分子混合。

3.根據權利要求1所述的一種基于信號組合編碼的DNA連接測序方法，其特征在于所述的 測序引物是指一組只能和所有DNA模板的一段通用序列雜交的寡核苷酸片段，一組測序 引物在DNA模板上雜交區域彼此相差一個或數個堿基，能夠在數輪測序反應中完成對 DNA模板全長的測序工作；測序模板上的通用序列，是在測序模板制備過程中通過連接 反應加入，或者在擴增過程中通過引物引入。

4.根據權利要求1所述的一種基于信號組合編碼的DNA連接測序方法，其特征在于所述的 DNA模板是通過對待測的DNA片段通過DNA擴增技術增加基因組中感興趣的目的片段 的量，擴增是單重的，即一次擴增一個目的片段，或者是多重的，即一次擴增多個目的片 段；所述的待測的DNA模板中的固定是通過化學或者物理方法固定于平面片基上，或固 定于“96孔板”、“384孔板”及各種修飾的珠子載體上。

5.根據權利要求1所述的一種基于信號組合編碼的DNA連接測序方法，其特征在于所述的 標記物，是采用的熒光基團，或利用測序探針化學的、物理的性質的改變。

6.根據權利要求1所述的一種基于信號組合編碼的DNA連接測序方法，其特征在于所述的 標記物的移除，是標記基團通過化學的、物理的方法與DNA測序探針分離，或者DNA 測序探針化學的、物理的性質恢復原有狀態；標記物的移除，是僅僅移除標記物本身，或 者同時移除與標記物相連或不相連的一個或多個堿基及相關基團。

7.根據權利要求1所述的一種基于信號組合編碼的DNA連接測序方法，其特征在于所述的 第二條測序引物是一組測序引物中除已經使用的測序引物中的任何一條，并不一定是與已 使用的測序引物對應在測序模板上雜交位置最為接近的一條。