[發明專利]小干擾RNA快速篩選的載體及其構建方法和應用

無效

• 申請號: 200910022909.6
• 申請日: 2009-06-11
• 公開（公告）號: CN101633930A
• 公開（公告）日: 2010-01-27
• 發明（設計）人: 夏海濱;邊曄;王東陽;孫曉聰;馮真真;李婧;鄭曉晶
• 申請（專利權）人: 陜西師范大學
• 主分類號: C12N15/65
• 分類號: C12N15/65;C12N15/53;C12N15/66;C12Q1/68;G01N21/76
• 代理公司: 西安永生專利代理有限責任公司
• 代理人: 申忠才

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種小干擾RNA快速篩選的載體及其構建方法和應用。?

技術背景

RNA干擾技術是指小的雙鏈RNA可以引起靶分子mRNA的特異降解。能夠引起mRNA的特異降解的長度約19～21堿基的雙鏈RNA稱之為小干擾RNA(small?interfering?RNA，siRNA)。siRNA已被廣泛應用于基因表達調控、基因功能及疾病的治療研究，并成為分子生物學最熱點的研究領域之一。在美國小干擾RNA已進入疾病治療的臨床試驗一、二期階段(如老年性黃斑病，age-relatedmacular?degeneration，AMD)。預計小干擾RNA也將很快進入其它疾病(如腫瘤，病毒性疾病及神經退行性疾病等)的臨床試驗治療階段。此外，在后基因組時代，小干擾RNA在基因的功能研究中也將會起到非常重要的作用。?

在真核細胞中通常是小干擾RNA(19-21堿基雙鏈RNA)發揮作用。篩選有效的小干擾RNA靶片段對于RNA的干擾效果具有重要意義。目前篩選有效干擾RNA片段的方法有多種：(1)Westernblot(2)RT-PCR(3)Northern?blot(4)real-time?PCR等，所有這些方法都比較費時，復雜，穩定性較差。?

發明內容

本發明所要解決的一個技術問題在于提供一種用于小干擾RNA快速篩選的載體。?

本發明所要解決的另一個技術問題在于提供一種快速、簡便的用于小干擾RNA快速篩選的載體的構建方法。?

本發明所要解決的還有一個技術問題在于提供一種用于小干擾RNA快速篩選的載體的用途。?

解決上述技術問題所采用的技術方案是：小干擾RNA快速篩選載體具有一個3.0kb的骨架載體并含有一個多克隆位點，在載體5’端的多克隆位點處存在報告基因及用于插入一個篩選靶基因表達元件的多克隆位點，其下游存在兩個相反方向的任意兩個不同的pIII啟動子，兩個啟動子之間有兩個酶切位點，并在兩個酶切位點之間插入一個用于藍白斑篩選的表達元件，在載體的3’端多克隆位點處插入一個內參報告基因。?

本發明的載體5’端多克隆位點處存在的報告基因及插入所篩選靶基因的表達元件為：?

1、所采用的報告基因是EGFP-Flag融合蛋白或是熒光素酶-Flag。?

2、插入所篩選靶基因是克隆在報告基因終止碼之后，兩者不能形成一個融合蛋白，所篩選的基因作為3’端非翻譯區的一部分。?

3、報告基因及插入所篩選靶基因擁有同樣一個啟動子及poly?A。?

本發明的任意兩個不同的pIII啟動子為H1和U6。?

本發明的在兩個啟動子之間插入的一個用于藍白斑篩選的表達元件為細菌lacz?alpha表達元件。?

本發明的載體的3’端多克隆位點處插入的內參報告基因為RFP或EGFP基因。?

上述小干擾RNA快速篩選的載體的構建方法包括下述步驟：?

1、構建小干擾RNA載體的基本骨架?

該基本骨架為3.0kb，并含有一個多克隆位點。?

2、構建報告基因-Flag表達元件的載體?

經過PCR擴增報告基因-Flag融合蛋白基因，PCR擴增25～35個循環，經轉化感受態細胞DH5α、挑菌、堿性裂解法提取質粒DNA，經酶切鑒定，將陽性克隆經過NheI+BamHI雙酶切與同樣的酶切處理后pEAAL-CMV載體連接，獲得的載體稱之為pEAAL-CMV-報告基因-Flag，PCR擴增SV40pA，經XbaI+KpnI酶切與pEAAL-CMV-報告基因-Flag連接，獲得報告基因-Flag表達元件的載體pEAAL-CMV-報告基因-Flag-SV40pA，在FLAG的3’端含有一個終止碼，在終止碼與pA之間有一多克隆位點，獲得eGFP-Flag表達元件的載體。?

3、構建小干擾RNA表達載體?

報告基因-Flag表達元件的下游，通過PCR的方法將人H1啟動子經KpnI+XhoI雙酶切后克隆到pEAAL-CMV-報告基因-Flag-SV40pA載體中；在以上載體中將人mU6啟動子經SpeI+SfuI雙酶切后克隆到載體中，將用于藍白斑篩選的表達元件經XhoI+SpeI雙酶切后克隆到人H1及人mU6啟動子之間，獲得小干擾RNA表達載體。?

4、構建小干擾RNA快速篩選的載體?