[發(fā)明專利]小干擾RNA快速篩選的載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910022909.6
• 申請日: 2009-06-11
• 公開（公告）號: CN101633930A
• 公開（公告）日: 2010-01-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 夏海濱;邊曄;王東陽;孫曉聰;馮真真;李婧;鄭曉晶
• 申請（專利權(quán)）人: 陜西師范大學(xué)
• 主分類號: C12N15/65
• 分類號: C12N15/65;C12N15/53;C12N15/66;C12Q1/68;G01N21/76
• 代理公司: 西安永生專利代理有限責(zé)任公司
• 代理人: 申忠才

1.一種小干擾RNA快速篩選的載體，其特征在于：小干擾RNA快速篩選載體具有一個3.0kb 的骨架載體并含有一個多克隆位點，在所述的快速篩選載體5’端的多克隆位點處存在報告基因表 達(dá)原件及用于插入一個篩選靶基因表達(dá)元件的多克隆位點，其下游存在兩個相反方向的任意兩個 不同的pIII啟動子，兩個啟動子之間有兩個酶切位點，并在兩個酶切位點之間插入一個用于藍(lán)白斑 篩選的表達(dá)元件，在所述的快速篩選載體的3’端多克隆位點處插入一個內(nèi)參報告基因表達(dá)原件； 所述的篩選靶基因是克隆在報告基因終止碼之后。

2.按照權(quán)利要求1所述的小干擾RNA快速篩選的載體，其特征在于所說的快速篩選載體5’ 端多克隆位點處存在的報告基因及插入所篩選靶基因的表達(dá)元件為：

(1)所采用的報告基因是EGFP-Flag融合蛋白或是熒光素酶-Flag；

(2)插入所篩選靶基因是克隆在報告基因終止碼之后，兩者不能形成一個融合蛋白，所篩選 的基因的轉(zhuǎn)錄本作為3’端非翻譯區(qū)的一部分；

(3)報告基因及插入所篩選靶基因擁有同樣一個啟動子及poly?A。

3.按照權(quán)利要求1所述的小干擾RNA快速篩選的載體，其特征在于：所說的任意兩個不同的 pIII啟動子為H1和U6。

4.按照權(quán)利要求1所述的小干擾RNA快速篩選的載體，其特征在于：所說的在兩個啟動子之 間插入的一個用于藍(lán)白斑篩選的表達(dá)元件為細(xì)菌lacz?alpha表達(dá)元件。

5.按照權(quán)利要求1所述的小干擾RNA快速篩選的載體，其特征在于：所說的快速篩選載體的 3’端多克隆位點處插入的內(nèi)參報告基因為RFP或EGFP基因。

6.一種小干擾RNA快速篩選的載體的構(gòu)建方法，其特征在于它包括下述步驟：

(1)構(gòu)建小干擾RNA載體的基本骨架

該基本骨架為3.0kb，并含有一個多克隆位點；

(2)構(gòu)建報告基因-Flag表達(dá)元件的載體

經(jīng)過PCR擴(kuò)增報告基因-Flag融合蛋白基因，PCR擴(kuò)增25～35個循環(huán)，經(jīng)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞 DH5α、挑菌、堿性裂解法提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)酶切鑒定，將陽性克隆經(jīng)過NheI+BamHI雙酶切與同 樣的酶切處理后pEAAL-CMV載體連接，獲得的載體稱之為pEAAL-CMV-報告基因-Flag，PCR擴(kuò)增 SV40pA，經(jīng)XbaI+KpnI酶切與pEAAL-CMV-報告基因-Flag連接，獲得報告基因-Flag表達(dá)元件的載 體pEAAL-CMV-報告基因-Flag-SV40pA，在FLAG的3’端含有一個終止碼，在終止碼與pA之間有 一多克隆位點，獲得eGFP-Flag表達(dá)元件的載體；

(3)構(gòu)建小干擾RNA表達(dá)載體

報告基因-Flag表達(dá)元件的下游，通過PCR的方法將人H1啟動子經(jīng)KpnI+XhoI雙酶切后克隆 到pEAAL-CMV-報告基因-Flag-SV40pA載體中；在以上載體中將人mU6啟動子經(jīng)SpeI+SfuI雙酶 切后克隆到載體中，將用于藍(lán)白斑篩選的表達(dá)元件經(jīng)XhoI+SpeI雙酶切后克隆到人H1及人mU6 啟動子之間，獲得小干擾RNA表達(dá)載體；

(4)構(gòu)建小干擾RNA快速篩選的載體

通過PCR擴(kuò)增內(nèi)參報告基因，25～35個循環(huán)后收獲DNA，經(jīng)連接、挑菌，堿性裂解法提取質(zhì) 粒DNA，經(jīng)酶切鑒定，將陽性克隆經(jīng)過雙酶切克隆到中間載體，將表達(dá)內(nèi)參報告基因的表達(dá)元件經(jīng) SfuI+NotI酶切后克隆在mU6啟動子的下游，獲得構(gòu)建小干擾RNA快速篩選的載體。

7.按照權(quán)利要求6所述的小干擾RNA快速篩選的載體的構(gòu)建方法，其特征在于：所說的步 驟(2)中PCR擴(kuò)增報告基因不含有終止密碼子，并在3’端插入Flag?TAA序列。

8.按照權(quán)利要求6所述的小干擾RNA快速篩選的載體的構(gòu)建方法，其特征在于：所說的步 驟(2)中在同一CMV啟動子3’端，依次克隆報告基因和所篩選靶基因的表達(dá)元件。

9.權(quán)利要求1的小干擾RNA快速篩選的載體在篩選小干擾RNA中的用途。