[發明專利]一種利用SCAR標記進行大白菜品種鑒定和種子純度檢驗方法

無效

• 申請號: 200910022841.1
• 申請日: 2009-06-05
• 公開（公告）號: CN101565745A
• 公開（公告）日: 2009-10-28
• 發明（設計）人: 張魯剛;王綺;張明科;惠麥俠;張戰風
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 西安西達專利代理有限責任公司
• 代理人: 李文義

技術領域

本發明屬于農業的蔬菜品種鑒定與良種領域，涉及白菜的品種鑒定和種子純度檢驗方法，特別是一種利用SCAR標記進行“金冠2號”大白菜的品種鑒定和種子純度檢驗方法。

背景技術

對雜種種子遺傳學純度的檢驗，越來越引起種子生產單位的特別重視。雖然田間形態學鑒定結果可靠，實施簡單，但檢測周期長，耗時費工，難以滿足當年收獲，當年用種的要求。同功酶和蛋白質電泳技術已經在一些十字花科蔬菜作物品種及雜種純度檢驗中得到了應用，但是由于其存在組織特異性，在不同器官、不同生長時期帶型差異不穩定等因素，及其多態性不豐富，譜帶較少，差異有限等缺陷，難以滿足越來越多的品種檢測要求。

分子標記是近年來研究的熱門領域，它以DNA為研究對象，具有以下優越性：(1)直接以DNA的形式表現，在植物體的各個組織、各發育時期均可檢測到，不受季節、環境限制，不存在表達與否的問題；(2)數量極多，遍及整個基因組，可檢測到的基因座位幾乎是無限的；(3)多態性高，自然界存在著許多等位變異，不需專門創造特殊的遺傳材料；(4)表現為“中性”，不影響目標性狀的表達，與不良性狀無必然的連鎖；(5)有許多分子標記表現為共顯性(codominance)，能夠鑒別出純合基因型與雜合基因型，提供完整的遺傳信息，因而現已形成許多分子標記系統。

PCR技術是近年來發展起來的DNA分子標記之一，與RFLP相比，RAPD標記具有以下特點：(1)RAPD的引物具有通用性，同一套引物可適用于不同生物基因組的分析。相反RFLP標記具有種族特異性，只在一定的種屬范圍內可相互使用；(2)RAPD技術簡單成熟，可程序化作業，特別適于大批量檢測；(3)由于引物的隨機性，RAPD標記幾乎可覆蓋整個基因組；(4)RAPD標記一般表現為顯性遺傳，不能區分雜合型和純合型；(5)RAPD標記一般可以同時檢測多個位點，很適于快速構建遺傳圖譜和不同材料多態性篩選；(6)RAPD分析不使用同位素，因而比較安全，也不受特殊地區規定限制；(7)RAPD技術DNA用量少，不受植株生長條件、時期的限制。所以，RAPD分析非常適于大規模樣品的植物育種、種群遺傳學和生物多樣性等眾多研究領域。

SCAR標記，即序列特異擴增帶，是基于RAPD發展起來的一類標記，在對多態性RAPD產物測序的基礎上，設計一對新的引物，特異地擴增一個在遺傳上定義為一個位點的DNA區段。在對多態性RAPD產物測序的基礎上，設計一對新的引物，特異地擴增一個在特定位點的DNA片段，一般在原RAPD引物的3’與5’端延長14個堿基，利用兩端各24個堿基的引物進行特異擴增，因此，該方法與RAPD相比具有如下優點：由于使用較長的引物和高退火溫度，因此具有重復性和穩定性好，帶型簡單等優點，因此，SCAR標記成為分子育種、品種鑒定和種子純度檢驗的首選標記。

發明內容

本發明的目的是提供一種利用SCAR標記進行大白菜品種鑒定和種子純度檢驗方法。

為了實現上述目的，本發明采用的技術方案是，一種利用SCAR標記進行大白菜品種鑒定和種子純度檢驗方法，該方法以“金冠2號”父母本及F₁代種子為研究材料，首先進行PCR反應體系優化，篩選特異性引物，進一步對特異片段克隆測序，轉化為SCAR標記，應用于“金冠2號”大白菜品種鑒定和種子純度檢驗，其特征在于，具體包括以下步驟：

1)材料的準備：

以橙色大白菜新品種“金冠2號”及其親本種子催芽育苗后移栽至大田，在幼苗期單株編號，隨機選取100-200株，于苗期取幼嫩葉片提取DNA備用，成株期根據品種特性鑒定生物學性狀；

2)DNA提取：

采用CTAB法，其過程為，取0.2g幼嫩葉片，液氮下研磨成粉末；加入750μL?CTAB提取液后轉入至1.5mL離心管中；然后65℃水浴30min，其間振蕩混勻；分別用等體積的Tris-飽和酚、氯仿、異戊醇混合溶液和等體積的氯仿、異戊醇混合溶液各抽提一次，于常溫下在12000r/min條件下離心2次，每次10min；取上清液加入2倍體積預冷的無水乙醇沉淀DNA，于4℃條件下離心15min；離心轉速為12000r/min，離心后用70％乙醇清洗沉淀2～3次；加入DNA貯存液，經DNA純度檢測證實純化度，存于-20℃冰箱中備用；

3)SCAR引物設計：

母本特異性引物SC134-1200

fS134M：TGCTGCAGGTGAAGGCTGGTTC

rS134M：TGCTGCAGGTTATCCTTTTTGGTTG