[發(fā)明專利]一種利用SCAR標(biāo)記進(jìn)行大白菜品種鑒定和種子純度檢驗(yàn)方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910022841.1
• 申請(qǐng)日: 2009-06-05
• 公開（公告）號(hào): CN101565745A
• 公開（公告）日: 2009-10-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張魯剛;王綺;張明科;惠麥俠;張戰(zhàn)風(fēng)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西北農(nóng)林科技大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 西安西達(dá)專利代理有限責(zé)任公司
• 代理人: 李文義

1.一種利用SCAR標(biāo)記進(jìn)行大白菜品種鑒定和種子純度檢驗(yàn)方法，其特征在于，該方法以“金冠2號(hào)”父母本及F1代種子為研究材料進(jìn)行PCR反應(yīng)體系優(yōu)化，篩選特異性引物，進(jìn)一步對(duì)特異片段克隆測(cè)序，轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記，并將該SCAR標(biāo)記用于“金冠2號(hào)”大白菜品種鑒定和種子純度檢驗(yàn)，具體包括以下步驟：

1)材料的準(zhǔn)備：

以橙色大白菜新品種“金冠2號(hào)”及其親本種子催芽育苗后移栽至大田，在幼苗期單株編號(hào)，隨機(jī)選取100-200株，于苗期取幼嫩葉片提取DNA備用，成株期根據(jù)品種特性鑒定生物學(xué)性狀；

2)DNA提取：

采用CTAB法，其過程為，取0.2g幼嫩葉片，液氮下研磨成粉末；加入750μL?CTAB提取液后轉(zhuǎn)入至1.5mL離心管中；然后65℃水浴30min，其間振蕩混勻；分別用等體積的Tris-飽和酚、氯仿、異戊醇混合溶液和等體積的氯仿、異戊醇混合溶液各抽提一次，于常溫下在12000r/min條件下離心2次，每次10min；取上清液加入2倍體積預(yù)冷的無水乙醇沉淀DNA，于4℃條件下離心15min；離心轉(zhuǎn)速為12000r/min，離心后用70％乙醇清洗沉淀2～3次；加入DNA貯存液，經(jīng)DNA純度檢測(cè)證實(shí)純化度，存于-20℃冰箱中備用；

3)SCAR引物設(shè)計(jì)：

母本特異性引物SC134-1200

fS134M：TGCTGCAGGTGAAGGCTGGTTC

rS134M：TGCTGCAGGTTATCCTTTTTGGTTG

雜種特異性引物SC266-260

fS266-260F：AGGCCCGATGGAGTTTGTGTAAG

fS266-260F：AGGCCCGATGATGATAAATCATTG

4)SCAR-PCR擴(kuò)增：

采用25μL的PCR反應(yīng)體系，其中包括1×緩沖液，2.0mmol/L?MgCl₂，2.5mmol/L?dNTPs，0.3μmol/L引物，1U?TaqDNA聚合酶，30～50ng模板DNA；反應(yīng)程序：SCAR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4min，94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸90s，循環(huán)30次，最后72℃延伸10min；

擴(kuò)增產(chǎn)物在含5μg/mLEB的1.5％瓊脂糖膠，120V下電泳1.0h，電泳后在紫外燈下觀察并照相；

5)SCAR標(biāo)記的特征：

A、SC134-1200標(biāo)記：

用SC134-1200的SCAR引物對(duì)“金冠2號(hào)”群體鑒定，在母本和雜交種中可以擴(kuò)增出S134-1200的特異條帶，而父本及其自交苗中不能擴(kuò)出S134-1200的特異條帶，因此利用該比較可以正確的鑒定“金冠2號(hào)”反交種子；鑒定群體中有擴(kuò)增帶單株的比率就是反交種子的雜交率；

B、SC266-260標(biāo)記：

用SC266-260的SCAR引物對(duì)“金冠2號(hào)”群體鑒定，母本、父本均沒有擴(kuò)增帶，只有真雜種有擴(kuò)增帶，沒有擴(kuò)增帶的可能是假雜種；利用該比較可以正確的鑒定“金冠2號(hào)”正交、反交單收以及混收種子；鑒定群體中有擴(kuò)增帶單株的比率就是反交種子的雜交率。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用SCAR標(biāo)記進(jìn)行大白菜品種鑒定和種子純度檢驗(yàn)方法，其特征在于，所述的Tris-飽和酚、氯仿、異戊醇混合溶液的體積比為：Tris-飽和酚∶氯仿∶異戊醇＝25∶24∶1；所述的氯仿、異戊醇混合溶液的體積比為：氯仿∶異戊醇＝24∶1。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用SCAR標(biāo)記進(jìn)行大白菜品種鑒定和種子純度檢驗(yàn)方法，其特征在于，所述的DNA貯存液的組成為：70％體積分?jǐn)?shù)的乙醇，其中加入0.3moL/L?NaAc溶液。