[發明專利]一種四環素嚴緊調控的真核表達載體

無效

• 申請號: 200910021010.2
• 申請日: 2009-01-21
• 公開（公告）號: CN101481704A
• 公開（公告）日: 2009-07-15
• 發明（設計）人: 于軍;陳寶瑩;陳健康;劉利兵;張學策;劉芳娥;梁向艷;楊芳;黃小軍
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第四軍醫大學
• 主分類號: C12N15/79
• 分類號: C12N15/79;C12N15/64
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司
• 代理人: 陸萬壽

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，涉及一種四環素嚴緊調控的真核表達載體，特別涉及不同興趣外源性基因方便的重組入該載體，及轉染該載體顯陽性的細胞的篩選。

背景技術

飛速發展的功能基因組學的研究需要嚴緊調控的基因表達系統，以便外源基因在宿主細胞的表達能夠得到精確調控，使得其功能研究順利進行。近年來四環素(tetracycline，Tet)調控的基因表達系統得到廣泛的應用。Tet誘導的表達系統分為兩種：一種是Tet關閉型，另一種是Tet開放型。前者在沒有Tet和其衍生物強力霉素(doxycycline，Dox)存在的情況下組成型表達，在Tet或者Dox存在的情況下受到調控，表達系統關閉(Lee，Y.B.，A.S.Cosgrave，C.P.Glover，A.Bienemann，D.Heywood，R.J.Hobson?and?J.B.Uney.2005.Increased?utility?in?the?CNS?of?a?powerful?neuron-specific?tetracycline-regulatableadenoviral?system?developed?using?a?post-transcriptional?enhancer.J?Gene?Med.7：576-583.)；而后者在Tet或Dox存在的條件下表達系統被激活而表達(Gossen，M.，S.Freundlieb，G.Bender，G.Muller，W.Hillen?and?H?Bujard.1995.Transcri-ptional?activation?by?tetracyclines?in?mammalian?cells.Science.268：1766-1769.)。與Tet關閉型表達系統相比，Tet開放型表達系統的優點是：加入誘導劑產生的表達激活要比從Tet關閉型系統中去除Tet或Dox產生的表達激活效應快得多，因為Tet關閉型系統需要一定的藥物洗脫時間；此外Tet開放型系統可以通過加入不同劑量的誘導劑，控制目的基因的表達水平(Kistner，A.，M.Gossen，F.Zimmermann，J.Jerecic，C.Ullmer，H.Lubbert?and?H.Bujard.1996.Doxycycline-mediated?quantitative?and?tissue-specific?control?of?gene?expressionin?transgenic?mice.Proc?Natl?Acad?Sci?U?S?A.93：10933-10938.4)。

雖然目前已經有很多Tet或Dox誘導表達系統的報道(Georgievska，B.，J.Jakobsson，E.Persson，C.Ericson，D.Kirik?and?C.Lundberg.2004.Regulateddelivery?of?glial?ce11line-derived?neurotrophic?factor?into?rat?striatum，using?atetracycline-dependent?lentiviral?vector.Hum?Gene?Ther.15：934-944.；Aurisicchio，L.，A.De?Tomassi，N.La?Monica，G.Ciliberto，C.Traboni?and?F.Palombo，2005.Regulated?and?liver-specific?tamarin?alpha?interferon?genedelivery?by?a?helper-dependent?adenoviral?vector.J?Virol.79：6772-6780)，但存在的問題是，受Tet或Dox調控的目的基因置換不方便；例如經過高通量的方法篩選得到很多待檢測的興趣基因，就需要根據不同基因的序列和酶切位點，設計重組方案，采用傳統的酶切和連接方法，構建Tet或Dox調控系統，工作量大，費時費力。此外，在基因功能學的研究中，對于興趣基因的轉入、表達以及穩定表達體的獲取，都需要有相應的高效的篩選標記，這對于工作的成敗有至關重要的作用；現有的篩選標記還沒有達到簡潔、快速、方便的篩選效果。最后，目前報道的Tet或Dox誘導表達載體，具有真核復制子，轉入真核細胞后，能夠自主復制；雖然見效較快，但沒有整合到宿主基因組中的外源性基因，表達不夠穩定，在較長的時間(數月)之后有載體表達的減弱和丟失現象發生，影響對基因功能的長期研究。

發明內容