[發明專利]一種植物雙價表達載體及其構建方法

無效

• 申請號: 200910018527.6
• 申請日: 2009-09-11
• 公開（公告）號: CN102021197A
• 公開（公告）日: 2011-04-20
• 發明（設計）人: 李富超;任寶永;秦松;徐靜;王宏華;侯艷華
• 申請（專利權）人: 中國科學院海洋研究所
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 許宗富;周秀梅

技術領域

本發明涉及植物基因工程領域，具體的說是到一種將雨生紅球藻中的β-胡蘿卜素酮化酶基因(bkt)和β-胡蘿卜素羥化酶基因(crtR-B)同步轉化植物雙價表達載體及其構建方法。

技術背景

蝦青素是一種具有極強抗氧化活性的類胡蘿卜素，具有廣泛的應用價值。單細胞綠藻雨生紅球藻在環境脅迫條件下可以合成并積累蝦青素，含量高達細胞干重的4％，是其它生物的一到幾個數量級，成為目前首選的天然蝦青素合成工具。雨生紅球藻的蝦青素是在一系列酶的作用下合成的，其中β-胡蘿卜素酮化酶和β-胡蘿卜素羥化酶是兩個關鍵酶，它們共同作用轉化β-胡蘿卜素形成蝦青素(Grunewald?K等，2000，Plant?Physiol，122：1261-1268)。這兩個酶皆是雙功能酶，β-胡蘿卜素酮化酶能分別以β-胡蘿卜素和玉米黃素為底物，在C4和C4′位上引入酮基(Fraser?PD等，1998，Eur?J?Biochem，252：229-236)；β-胡蘿卜素羥化酶能分別以β-胡蘿卜素和角黃質為底物，在C3和C3′位分別引入一個羥基(Linden?H，1999，BiochimBiophys?Acta，1446：203-212)。在玉米、花生等植物中一般不合成蝦青素，所以要利用其它植物中的前體物質合成蝦青素，β-胡蘿卜素酮化酶和β-胡蘿卜素羥化酶是必不可少的。

現已將雨生紅球藻(Haematococcus?pluvialis)中的bkt基因(GenBank序列號：D45881)和crtR-B基因(GenBank序列號：AF162276)克隆出來，這使得運用代謝工程手段在高等植物中合成生產大量天然蝦青素成為可能，現在已經有科研人員在這一領域進行了嘗試。Mann等將克隆到的β-胡蘿卜素酮化酶基因與番茄pds基因啟動子結合轉入煙草后，植株葉片中類胡蘿卜素成分及含量沒有改變，但在花的蜜腺有色體中積累了高濃度的蝦青素，使花的顏色從黃變紅(Mann?V等，2000，Nat?Biotechnol，18：888-892)。結構分析顯示，轉基因煙草形成的蝦青素與雨生紅球藻形成的天然蝦青素具有相同的空間螺旋特性。Ralley等將β-胡蘿卜素酮化酶和β-胡蘿卜素羥化酶基因與導肽融合，并在煙草花葉病毒的CaMV35S啟動子的驅動下轉入番茄和煙草，也成功地在番茄及煙草的葉片中得以表達(Ralley?L，2004，The?Plant?Journal，39：477-486)。然而這些工作主要是將bkt或crtR-B中的單一基因轉進植物，或是將兩個基因連接在同一啟動子下啟動，而當將兩個基因構建在同一載體上并分別由兩個啟動子啟動調控時是否能提高蝦青素的含量還不得而知，因此構建含有β-胡蘿卜素酮化酶基因和β-胡蘿卜素羥化酶基因的植物雙價表達載體，使兩個基因同時轉入植物，對通過基因工程手段提高轉化植物中蝦青素合成量的研究具有重要意義。

發明內容

本發明的目的在于提供將雨生紅球藻中的β-胡蘿卜素酮化酶基因(bkt)和β-胡蘿卜素羥化酶基因(crtR-B)同步轉化植物雙價表達載體及其構建方法。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：

1.植物雙價表達載體序列表SEQ?ID?No.1中的堿基序列所示，其為β-胡蘿卜素酮化酶基因(bkt)和β-胡蘿卜素羥化酶基因(crtR-B)共同插入到pCAMBIA1301表達載體上，得到的植物雙價表達載體。

2.所述植物雙價表達載體總長度為12727bp，bkt和crtR-B基因的表達均由各自上游的CaMV35S啟動子啟動。