[發明專利]一種植物雙價表達載體及其構建方法

無效

• 申請號: 200910018527.6
• 申請日: 2009-09-11
• 公開（公告）號: CN102021197A
• 公開（公告）日: 2011-04-20
• 發明（設計）人: 李富超;任寶永;秦松;徐靜;王宏華;侯艷華
• 申請（專利權）人: 中國科學院海洋研究所
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 許宗富;周秀梅

1.一種植物雙價表達載體，其特征在于：植物雙價表達載體序列表SEQID?No.1中的堿基序列所示，其為β-胡蘿卜素酮化酶基因(bkt)和β-胡蘿卜素羥化酶基因(crtR-B)共同插入到pCAMBIA1301表達載體上，得到的植物雙價表達載體。

2.按權利要求1所述的植物雙價表達載體，其特征在于：所述植物雙價表達載體總長度為12727bp，bkt和crtR-B基因的表達均由各自上游的CaMV35S啟動子啟動。

3.一種按權利要求1所述的植物雙價表達載體的構建方法，其特征在于：首先，從雨生紅球藻中克隆β-胡蘿卜素酮化酶基因(bkt)和β-胡蘿卜素羥化酶基因(crtR-B)；其次，將得到的bkt和crtR-B分別連接在兩條pET-28a(+)載體上得到pET-28a(+)-bkt和pET-28a(+)-crtR-B載體；再次，以pET-28a(+)-bkt為模板，P₁和P₂為引物PCR擴增，產物經BamHI和SacI酶切回收片段和pBI221載體用T₄DNA連接酶連接，得到pBI221-bkt中間載體，之后再用HindIII、EcoRI雙酶切該中間載體和pCAMBIA1301載體，并用T₄?DNA連接酶連接得到pCAMBIA1301-bkt中間載體；最后，以pET-28a(+)-crtR-B為模板，P₃和P₄為引物PCR擴增，產物和pCAMBIA1301-bkt中間載體經BglII和BstEII酶切，回收的片段由T₄?DNA連接酶將crtR-B基因正向連接到酶切后的pCAMBIA1301-bkt載體上，即得序列表SEQ?ID?No.1中的堿基序列所示的植物雙價表達載體。

4.按權利要求3所述的植物雙價表達載體的構建方法，其特征在于：所述P₁、P₂、P₃、P₄引物分別為：P₁：5′AAAGGATCCATGCACGTCGCATC?3′、P₂：5′AACGAGCTCTCATGCCAAGGCAG?3′、P₃：5′CCCAGATCTATGCTGTCGAAGCTGC?3′、P₄：5′AAAGGTCACCCTACCGCTTGGACCA?3′。

5.按權利要求3所述的植物雙價表達載體的構建方法，其特征在于：所述bkt基因上游具有35S啟動子，下游具有NOS終止信號，構建成35S-bkt-NOS片段，該片段反向插入到pCAMBIA1301載體上；crtR-B基因上游具有35S啟動子，下游具有NOS終止信號，構成35S-crtR-B-NOS片段，該片段正向插入在pCAMBIA1301載體上。