[發(fā)明專(zhuān)利]一種改進(jìn)的GFP表達(dá)細(xì)胞的增殖檢測(cè)方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910018235.2
• 申請(qǐng)日: 2009-09-01
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101643780A
• 公開(kāi)（公告）日: 2010-02-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王旭平
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 山東大學(xué)齊魯醫(yī)院
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68;C12Q1/00;G01N21/64
• 代理公司: 濟(jì)南圣達(dá)專(zhuān)利商標(biāo)事務(wù)所有限公司
• 代理人: 楊 琪

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種改進(jìn)的GFP表達(dá)細(xì)胞的增殖檢測(cè)方法。?

背景技術(shù)

綠色熒光蛋白(GFP)是從水母體內(nèi)分離獲得的一種發(fā)光蛋白，吸收藍(lán)光，發(fā)綠光，且不需光發(fā)射輔因子。由于GFP在哺乳動(dòng)物細(xì)胞穩(wěn)定、熒光顯微鏡又容易檢測(cè)，因此GFP已是常用的標(biāo)記分子，是目前分子生物學(xué)家和細(xì)胞生物學(xué)家用于目的蛋白示蹤和定量的最有用的研究工具。但對(duì)表達(dá)GFP的細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)固定(常用的固定液有：70％乙醇、4％多聚甲醛、丙酮、甲醇等)、核酸變性(甲酰胺、鹽酸)、多重染色后，GFP信號(hào)明顯減弱，甚至無(wú)法檢測(cè)。圖像結(jié)果往往需要進(jìn)行后期處理。?

BrdU是用于標(biāo)記增殖分裂的細(xì)胞，屬于DNA結(jié)合型熒光染料，其基本原理是利用溴化脫氧尿嘧啶(BrdU)作為胸苷類(lèi)似物可以摻入到新增殖細(xì)胞合成DNA中。BrdU會(huì)隨著細(xì)胞分裂而不斷被“稀釋”，以至于最終完全不能檢出，因而不適合做長(zhǎng)時(shí)期的體內(nèi)標(biāo)記追蹤。其主要優(yōu)點(diǎn)是抗BrdU抗體與BrdU反應(yīng)后顯色可即刻顯現(xiàn)標(biāo)記的情況，其缺點(diǎn)細(xì)胞分裂時(shí)標(biāo)記強(qiáng)度降低或標(biāo)記丟失，增殖的細(xì)胞逐漸降低細(xì)胞BrdU標(biāo)記。因此，BrdU適用于短期標(biāo)記增殖的細(xì)胞。?

DAPI，4’，6-diamidino-2-phenylindole，dihydrochloride(DAPI)，中文名稱(chēng)是4’，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚，是一種常用的顯現(xiàn)活細(xì)胞或固定細(xì)胞DNA的熒光染料，其作用機(jī)理與溴化乙錠等染色劑的機(jī)理類(lèi)似：它們與DNA雙螺旋的凹槽部分可以發(fā)生相互作用，從而與DNA的雙鏈緊密結(jié)合。沒(méi)結(jié)合DNA的DAPI熒光很弱，而一旦和DNA結(jié)合，表現(xiàn)出很強(qiáng)的熒光。并且對(duì)細(xì)胞相對(duì)無(wú)毒，不改變細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。結(jié)合后產(chǎn)生的熒光基團(tuán)的吸收峰是358nm而散射峰是461nm，正好UV(紫外光)的激發(fā)波長(zhǎng)正好是356nm，使得DAPI成為了一種常用的熒光檢測(cè)信號(hào)。DAPI最大的優(yōu)點(diǎn)就是標(biāo)記技術(shù)簡(jiǎn)單，而標(biāo)記效率很高(起初達(dá)100％)，標(biāo)記的細(xì)胞能清楚的觀察到；缺點(diǎn)是細(xì)胞分裂將導(dǎo)致DAPI淬滅，以及收縮蛋白或其它蛋白染色所造成的強(qiáng)背景色等將引起標(biāo)記強(qiáng)度降低。因此DAPI也僅適于短期定量分析。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是：改進(jìn)以往的細(xì)胞固定、核酸變性方法及處理時(shí)間，從而達(dá)到各染色結(jié)果互不干擾，GFP顏色明亮易檢的目的。?

針對(duì)上述目的，本發(fā)明提供了一種改進(jìn)的GFP表達(dá)細(xì)胞的增殖檢測(cè)方法，解決了傳統(tǒng)固?定、染色方法處理后GFP顏色減弱的問(wèn)題，使GFP顏色明亮，易于檢測(cè)；且避免了甲酰胺、鹽酸酸化等方法步驟繁瑣的缺點(diǎn)。?

本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：?

一種改進(jìn)的GFP表達(dá)細(xì)胞的增殖檢測(cè)方法：對(duì)以綠色熒光蛋白(GFP)作為報(bào)告蛋白的細(xì)胞進(jìn)行BrdU摻入染色和DAPI復(fù)染，然后常規(guī)防熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡觀察，拍照。?

具體使用時(shí)，可以采用以下步驟：?

1)向表達(dá)GFP的細(xì)胞內(nèi)加入BrdU至終濃度30μg/ml，37℃培養(yǎng)條件下標(biāo)記0.5～3h(視細(xì)胞增殖能力而定)；?

2)以Hank’s液配制0.1％甲醛(體積濃度)，培養(yǎng)條件下固定細(xì)胞10～12h；?

3)Hank’s液沖洗3次，每次5min；?

4)0.2％Triton?X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)作用20min；?

5)用Hank’s液沖洗3次，每次5min；?

6)100U/ml?DNase?I(脫氧核糖核酸酶I)，室溫處理5min；?

7)TBS沖洗3次，每次5min；?

8)室溫封閉液封閉1h；?

9)加入抗BrdU一抗，4℃濕盒中過(guò)夜；?

10)TBS沖洗3次，每次5min；?

11)加入二抗，37℃孵育30min；?

12)TBS沖洗3次，每次5min；?

13)加入DAPI，室溫2min；?

14)TBS沖洗3次，每次5min；?

15)防熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡觀察，拍照。?

所述培養(yǎng)條件是指5％CO₂、飽和濕度、溫度37℃。?