[發(fā)明專利]一種現(xiàn)場檢測免疫芯片及其制備方法與應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910017832.3
• 申請日: 2009-08-07
• 公開（公告）號: CN101629953A
• 公開（公告）日: 2010-01-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 繩秀珍;徐曉麗;戰(zhàn)文斌
• 申請（專利權(quán)）人: 中國海洋大學
• 主分類號: G01N33/552
• 分類號: G01N33/552;G01N33/569;G01N33/577;G01N33/532;G01N33/52
• 代理公司: 青島海昊知識產(chǎn)權(quán)事務(wù)所有限公司
• 代理人: 王 鐸

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種現(xiàn)場檢測免疫芯片或微陣列及其制備方法，為病原檢測技術(shù)的改進，具體涉及一種采用標記辣根過氧化物酶技術(shù)制備用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中現(xiàn)場檢測一種或幾種水產(chǎn)動物病毒的免疫芯片的方法與應(yīng)用，其屬于免疫學、生物芯片及診斷試劑交叉技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

病毒性疾病是水產(chǎn)養(yǎng)殖動物病害中最難以預(yù)防和治療的一類疾病，由于水產(chǎn)動物所處的特定水生環(huán)境以及病毒獨特的生物學特性，使得病毒病的預(yù)防及治療較其他陸生動物更加困難。目前尚無有效的治療病毒病的方法，因此預(yù)防病毒感染顯得尤為重要，而對病毒攜帶者的準確檢測和診斷是有效預(yù)防的基礎(chǔ)。國內(nèi)外對水產(chǎn)動物病毒病的診斷主要依靠實驗室內(nèi)對病原的檢測來實現(xiàn)，方法主要包括電鏡技術(shù)；PCR法；DNA探針原位雜交法；免疫熒光抗體技術(shù)；免疫組織化學技術(shù)；膠體金免疫層析技術(shù)；酶聯(lián)免疫吸附檢測法以及斑點免疫印跡檢測法等。這些檢測技術(shù)在靈敏度、準確性、特異性、實用性、檢測成本等方面各有其優(yōu)勢，但在實際應(yīng)用中大多需要較長的時間和專用實驗設(shè)備，不適于養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中病原的現(xiàn)場檢測，養(yǎng)殖生產(chǎn)中急需一種憑借肉眼觀察就可以判讀檢測結(jié)果的快速檢測診斷技術(shù)。膠體金免疫層析技術(shù)檢測結(jié)果肉眼可見，適用于實際生產(chǎn)中病原的快速、準確、現(xiàn)場檢測，但其不能實現(xiàn)多樣品的同時檢測。因此研制一種適用于水產(chǎn)養(yǎng)殖動物病毒性病原的快速、準確、現(xiàn)場、簡便、多樣品并行處理的檢測技術(shù)勢在必行，以期達到早發(fā)現(xiàn)、早預(yù)防的目的。

蛋白質(zhì)芯片技術(shù)提供了一種多樣品多指標檢驗并行處理的方法，有效地克服了以上檢測技術(shù)的缺點。常規(guī)免疫標記的蛋白質(zhì)芯片，多將熒光探針標記在可與待測物質(zhì)結(jié)合的蛋白質(zhì)上，憑借專用設(shè)備來讀取檢測信號，使用范圍受到一定的限制。而免疫酶技術(shù)由來已久，用途廣泛，目前常用于標記的辣根過氧化物酶(Horseradish?peroxidase，HRP)性質(zhì)穩(wěn)定，分子量小，純酶容易制備，經(jīng)底物催化后，結(jié)果肉眼可見。將免疫酶技術(shù)與蛋白芯片技術(shù)結(jié)合，制備出一種可用于多個樣品同時并行檢測，檢測結(jié)果肉眼可見，使用簡便、快速的現(xiàn)場檢測免疫芯片，可以很好地解決常規(guī)蛋白質(zhì)芯片難以在養(yǎng)殖生產(chǎn)現(xiàn)場普及應(yīng)用的缺點。

蛋白芯片的制備過程中，片基的選擇和處理是很關(guān)鍵的，它不但要對蛋白質(zhì)有較強的固定能力，還要保持所固定蛋白質(zhì)的活性。目前大部分芯片都采用玻片作為基片，基片的修飾方式大體分為兩種，一種為二維修飾，常用的有氨基、醛基、巰基、多聚賴氨酸等，利用它們的活性基團與蛋白質(zhì)的活性基團以共價方式連接在一起從而達到固定蛋白質(zhì)的目的，另一種為三維修飾，常用的即為瓊脂糖、丙烯酰胺、硝化纖維等，與二維表面相比，其表面不僅有多孔結(jié)構(gòu)，還有一定厚度，其三維多孔結(jié)構(gòu)可以使蛋白質(zhì)以物理吸附的方式固定在其上面，而瓊脂糖是一種常用的分子生物學試劑，價格比較便宜，且具有較好的生物相容性，同時，其親水環(huán)境還有利于保持固定在上面的蛋白質(zhì)的活性，目前瓊脂糖修飾片基在蛋白芯片的制備中已有應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種能同時檢測多種水產(chǎn)動物樣品中的病毒的現(xiàn)場檢測免疫芯片，檢測結(jié)果肉眼可見，適用于養(yǎng)殖生產(chǎn)中一種或幾種水產(chǎn)動物病毒的快速、準確檢測，及進出口水產(chǎn)品中病毒的檢疫。

本發(fā)明的另一個目的是提供上述現(xiàn)場檢測免疫芯片的具體制備方法及其在水產(chǎn)動物病毒檢測中的應(yīng)用。

本發(fā)明的原理是：采用雙抗體夾心原理檢測抗原，將水產(chǎn)動物病原的相應(yīng)捕獲抗體、陽性對照、陰性對照同時點陣于固相載體上，抗體蛋白通過共價鍵及物理吸附連接于固相載體上。直接將待檢樣品液與芯片孵育，樣品中的待測抗原與固定在芯片上的相應(yīng)的抗體結(jié)合，再加入辣根過氧化物酶標記的特異性單克隆抗體(單抗)探針，經(jīng)底物顯色后得到肉眼可見的檢測結(jié)果。所述固相載體為瓊脂糖修飾的載玻片。所述的待檢樣品液為水產(chǎn)動物病毒感染靶器官的組織勻漿液。