[發(fā)明專利]一種現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)免疫芯片及其制備方法與應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910017832.3
• 申請(qǐng)日: 2009-08-07
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101629953A
• 公開(kāi)（公告）日: 2010-01-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 繩秀珍;徐曉麗;戰(zhàn)文斌
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)海洋大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N33/552
• 分類號(hào): G01N33/552;G01N33/569;G01N33/577;G01N33/532;G01N33/52
• 代理公司: 青島海昊知識(shí)產(chǎn)權(quán)事務(wù)所有限公司
• 代理人: 王 鐸

1、一種現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)免疫芯片，其特征在于包括芯片載體、鋪覆于芯片載體上的瓊脂糖凝膠層，瓊脂糖凝膠層上固定多個(gè)抗體微陣列，各個(gè)微陣列之間用芯片專用圍欄或Super?PAP?Pen劃線隔開(kāi)；所述的芯片載體為標(biāo)準(zhǔn)載玻片，芯片載體具有經(jīng)過(guò)親和硅烷處理后，并用瓊脂糖凝膠修飾的玻璃表面，該表面經(jīng)NaIO₄活化后，使抗體以物理吸附和共價(jià)連接兩種方式固定在其上。

2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)免疫芯片，其特征在于所述的抗體是兔抗白斑癥病毒(WSSV)抗體或兔抗淋巴囊腫病毒(LCDV)抗體及兔抗鼠Ig的抗體。

3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)免疫芯片的制備方法，其特征是它包括如下步驟：

(1)抗體的制備及純化

制備兔抗WSSV抗體、兔抗LCDV抗體、鼠抗WSSV單克隆抗體(單抗)、鼠抗LCDV單抗及兔抗鼠Ig的抗體，親和層析法純化所得抗體；

(2)HRP標(biāo)記單克隆抗體探針的制備

將親和層析純化后的單抗(鼠抗WSSV單抗、鼠抗LCDV單抗)用HRP標(biāo)記，并過(guò)凝膠柱純化；

(3)瓊脂糖凝膠基片的制備

將清洗后的載玻片浸入0.4％的親和硅烷的乙酸溶液中，調(diào)pH至4.5，室溫下作用1h，雙蒸水沖洗，晾干；配制1.2％的瓊脂糖溶液，微波爐煮沸3min，使其完全溶解，將2ml瓊脂糖溶液鋪覆在經(jīng)60℃預(yù)熱的親和硅烷處理過(guò)的清潔載玻片上；待瓊脂糖凝固后，將玻片在37℃下過(guò)夜干燥；使用前在室溫下用0.02mol/L?NaIO₄溶液活化30min，超純水沖洗3遍，用氮?dú)饬鞔蹈桑覝馗稍锾幈４妫?/p>

(4)抗體的固定

將捕獲抗體(兔抗WSSV抗體或兔抗LCDV抗體、兔抗鼠Ig的抗體)用含50％甘油的PBS稀釋至合適濃度，用點(diǎn)樣儀在上述瓊脂糖修飾的玻片表面點(diǎn)樣，每張芯片兩排四列共8個(gè)4×4矩陣，每個(gè)亞陣列所點(diǎn)樣品一致，第一列所點(diǎn)樣品為磷酸鹽甘油緩沖液作為陰性對(duì)照，第二、三列所點(diǎn)樣品為捕獲抗體，為病原檢測(cè)點(diǎn)，第四列為質(zhì)量控制點(diǎn)，所點(diǎn)樣品為兔抗鼠Ig的抗體作為陽(yáng)性對(duì)照及固定對(duì)照。各個(gè)亞陣列之間用芯片專用圍欄或Super?PAP?Pen隔開(kāi)，形成獨(dú)立的反應(yīng)單元；37℃飽和濕度放置2h，洗滌，晾干；

向載玻片上點(diǎn)有抗體的區(qū)域滴加3％牛血清白蛋白封閉，37℃飽和濕度放置1h，洗滌，晾干，4℃密封保存，得到所述現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)免疫芯片。

4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)免疫芯片的制備方法，其特征在于用HRP標(biāo)記親和層析純化后的高特異性的單抗(鼠抗WSSV單抗、鼠抗LCDV單抗)作為抗體探針，并使用兔抗鼠Ig的抗體作為陽(yáng)性對(duì)照及固定對(duì)照。

5、根據(jù)權(quán)利要求3所述的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)免疫芯片的制備方法，其特征在于所述鼠抗WSSV單抗為保藏號(hào)分別為CCTCC-C200422和CCTCC-C200421的雜交瘤細(xì)胞分泌的鼠抗WSSV核衣殼單抗D和抗WSSV囊膜單抗E；鼠抗LCDV單抗為保藏號(hào)分別為CCTCC-C200419和CCTCC-C200420的雜交瘤細(xì)胞分泌的LCDV單抗B和單抗C。

6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)免疫芯片在水產(chǎn)動(dòng)物病毒檢測(cè)中的應(yīng)用。