[發明專利]蘇木素在測定細胞增殖活性和藥物對細胞毒效應中的應用

無效

• 申請號: 200910016250.3
• 申請日: 2009-06-23
• 公開（公告）號: CN101603068A
• 公開（公告）日: 2009-12-16
• 發明（設計）人: 張建華;王郡甫;陳紅
• 申請（專利權）人: 山東省醫學科學院基礎醫學研究所
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04;C12Q1/18
• 代理公司: 濟南圣達專利商標事務所有限公司
• 代理人: 楊 琪

技術領域

本發明涉及蘇木素在測定貼壁細胞增殖活性和藥物對貼壁細胞毒性作用中的應用。

背景技術

隨著抗腫瘤藥物開發的日益深入，愈來愈多中藥的抑瘤作用被世人關注，對這類藥物或 其提取物進行體外篩選亦是藥物開發過程的重要環節。采用穩定、可靠的檢測方法觀察藥物 對不同細胞系體外增殖抑制活性是必需的。

觀察細胞增殖活性及細胞毒性作用，常規采用四類方法：1、同位素方法，主要有³H-TdR 摻入法、¹²⁵I-UdR及⁵¹Cr釋放法，雖然這類方法敏感、特異，但存在對環境污染及需復雜昂貴 的儀器設備等諸多弊端。2、流式細胞儀分析法同樣具有敏感、特異等優點，但亦須昂貴復雜 的儀器設備，不易在基層推廣應用。3、Giemsa染色法、結晶紫、臺盼蘭等染色法，雖然簡 便、經濟，但存在結果不穩定和嚴重的非特異性吸附等缺點。4、酶底物法主要有傳統的MTT 比色法等，其特點是以活細胞的某種酶和相應底物之間的反應來顯示細胞數量和生存狀態， 優點是敏感快速及重復性較好，且對人體無損傷，通過對此方法的不斷改進完善，多年來一 直廣泛應用于細胞增殖和細胞毒性作用等研究領域。CCK-8是MTT的一種升級替代產品，其 作用原理與MTT相似，與MTT相比具有敏感性更高，且操作更簡便等優點，非常適合用于細 胞增殖和一般化學藥物的細胞毒性實驗。本研究在采用MTT比色法和CCK-8比色法觀察中藥 提取物金蕎麥對腫瘤細胞的毒性作用時發現MTT和CCK-8均與金蕎麥提取物發生不同程度的 非特異性反應，致使結果波動范圍較大，劑量依賴關系不明顯。基于上述所述，尋找特異、穩 定、簡便、經濟的體外藥物篩選方法已成當務之急。

蘇木素是一種天然染料，通過氧化變為蘇木紅，通常用于生物組織切片細胞核的染色。 本研究將蘇木素用于檢測貼壁細胞增殖和藥物對貼壁細胞毒性作用，蘇木素僅能被固定前的 活細胞吸附，活細胞數量越多，狀態越好，則染色越深，所測OD值越高；反之，活細胞數 量越少，狀態越差，則染色越淺，OD值越低，從而間接對活細胞的數量進行定量。目前尚 無將其用于測定貼壁細胞系體外增殖活性和藥物對貼壁細胞毒性作用的研究和報道。

發明內容

針對上述現有技術，本發明提供了蘇木素的一種新用途，即蘇木素在測定貼壁細胞增殖 活性和藥物對貼壁細胞毒性作用中的應用。本發明還建立了一套測定貼壁細胞增殖活性和藥 物對貼壁細胞毒性作用的檢測方法。本發明的檢測方法具有特異、穩定、簡便、經濟等優點。

本發明是通過以下技術方案實現的：

一種利用蘇木素測定貼壁細胞增殖活性的方法，步驟如下：取已稀釋好的待測細胞懸液， 置于細胞培養板的各相應孔中，每孔200μl，于37℃、體積分數為5％的CO₂飽和濕度條件 下，孵育44小時，甩棄上清，立即加入4％的多聚甲醛溶液，每孔100μl，固定20分鐘后收 集固定液(可反復利用)，PBS洗3次，每次200μl/孔，棄上清，室溫晾干；取蘇木素染色 液，每孔加入100μl，20分鐘后收集染色液(可反復利用)，蒸餾水洗3～5次，以去除未結合 的染料，室溫晾干；于倒置顯微鏡下觀察細胞著色狀況，再加入1％的鹽酸酒精，100μl/孔， 此時各孔液體呈現不同程度的粉紅色，20分鐘內用酶標儀測定540nm處的吸光度值并記錄， 取各組OD值均數并繪制細胞系增殖曲線。

一種利用蘇木素測定藥物對腫瘤細胞系毒性作用的方法，步驟如下：取待測細胞液，置 于細胞培養板的孔板中，每孔200μl，同時設定無藥物細胞對照和培養基酶標儀調零孔，于 37℃、體積分數為5％的CO₂飽和濕度條件下，孵育44小時；取出細胞培養板甩棄上清，立 即加入4％的多聚甲醛溶液，150μl/孔，固定20分鐘后收集固定液；PBS洗3次，每次200 μl/孔，棄上清，室溫晾干；取蘇木素染色液，每孔加入100μl，20分鐘后收集染色液；蒸 餾水洗3～5次以去除未結合的染料，室溫晾干；于倒置顯微鏡下觀察細胞著色狀況，再加入 1％的鹽酸酒精，100μl/孔，此時各孔液體呈現不同程度的粉紅色，20分鐘內用酶標儀測定 540nm處的吸光度值并記錄，按下式計算藥物的抑瘤率：

其中，OD值(試驗孔X)表示實驗組各孔OD值的均數；OD值(細胞對照孔X)表 示無藥細胞對照組各孔OD值的均數。