[發明專利]豬圓環病毒2型膠體金抗體快速檢測試紙條的制備方法

無效

• 申請號: 200910014999.4
• 申請日: 2009-05-08
• 公開（公告）號: CN101881770A
• 公開（公告）日: 2010-11-10
• 發明（設計）人: 周順;紀衛寧;崔尚金;李俊;王金寶;袁小遠
• 申請（專利權）人: 青島農業大學;中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所;山東省農業科學院畜牧獸醫研究所
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/558;G01N33/532;G01N33/552;C12P19/34;C12N15/70;C12P21/02;C12R1/19
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 劉德

技術領域

本發明涉及一種獸醫生物技術領域的診斷技術，具體地說是豬圓環病毒2型膠體金抗體快速檢測試紙條的制備方法。

背景技術

豬圓環病毒2型(porcine?circovirus?2，PCV2)是引起斷奶豬多系統衰竭綜合征(post-weaning?multisystemic?wasting?syndrome，PMWS)的病原，已廣泛受到了人們的重視。隨著對PCV2及其致病性的研究的深入，近來發現PCV2還與豬的繁殖障礙、斷奶豬和育肥豬的呼吸道疾病、皮炎與腎病綜合征(porcine?dermatisand?nephropathy?syndrome，PDNS)、幼齡仔豬的先天性震顫等疾病有關。近年來，我國規模化豬場PCV2感染以及由此引起的疾病愈來愈普遍，給我國養豬生產造成了較大的經濟損失。

目前，公知的豬圓環病毒2型抗體快速檢測試劑盒(ELISA法)，系采用酶聯免疫技術檢測樣品(血清)中豬圓環病毒2型抗體的方法。即：采用豬圓環病毒2型經純化、濃縮制成的抗原包被微孔板，在試驗中，加入稀釋的對照血清和待檢血清，經溫育后，若樣品中含有豬圓環病毒2型特異性抗體，則將與微孔板上抗原結合，經洗滌除去未結合的抗體和其他成分后；再加入酶標二抗，與微孔板上抗原抗體復合物發生特異性結合；再經洗滌除去未結合的酶結合物，在孔中加TMB或OPD底物液，與酶反應形成有色產物，加入終止液反應后，用酶標儀固定波長(450nm或630nm)測定各反應孔中的OD值。ELISA適合大批樣品的檢測，成為了一種常規的檢測方法。但是，該方法抗原的制備過程必須經過病毒的細胞培養、病毒純化等繁瑣模式，特異性不高、穩定性差，而且成本高；檢測時需要專門的儀器設備如酶標儀來配合使用，檢測操作人員需要經過專業培訓；操作過程相對比較復雜；檢測所需要時間比較長；檢測所需費用高。

發明內容

本發明的目的是為了克服當前技術在推廣使用中存在的缺陷，提供一種豬圓環病毒2型膠體金抗體快速檢測試紙條的制備方法。

本發明的目的是針對目前我國豬圓環病毒病普遍存在，給養豬業帶來嚴重經濟損失及缺乏現場操作簡便的試劑盒的現狀，提供一種提供一種不需要特定儀器設備輔助的檢測試劑，并能有效地降低檢測成本，能夠應用于大規模現地檢樣的診斷方法。

本發明的豬圓環病毒2型膠體金抗體快速檢測試紙條的制備方法是通過以下技術方案實現的：

利用基因工程表達豬圓環病毒2型ORF2蛋白，采用酶聯免疫原理和膜層析技術制成快速檢測豬血液或血清中的抗體。豬圓環病毒2型膠體金抗體快速檢測試紙條包括樣品墊、結合墊、硝酸纖維膜(NCM)和吸水墊和PVC板。按照正確地順序固定在PVC板上。PVC板一端依次粘附樣品墊、結合墊，中間粘附硝酸纖維膜，另一端粘附吸水墊，其特征在于結合墊包被了基因工程表達的豬圓環病毒2型ORF2蛋白-膠體金結合物，將表達蛋白包被在硝酸纖維膜作為檢測線(T)，將兔抗豬圓環病毒2型抗體包被在硝酸纖維膜作為對照線(C)。可廣泛用于臨床豬圓環病毒病的檢測。與其他病毒無交叉反應，與ELISA、中和試驗兩種方法檢測的符合率分別為98.63％和95.83％，整個實驗僅需15分鐘。操作簡便、快速、準確、靈敏度高、直觀、結果容易判定。

一、基因工程表達豬圓環病毒2型ORF2蛋白制備

1材料和方法：

1.2ORF2基因氨基端(737-421nt)的擴增

參照PCV2JXL序列，設計并合成1對引物，以重組質粒pMDT-PCV為模板，擴增ORF2基因的氨基端(737-421nt)部分片段。

CapL?5’?AGC?AAG?CTT?CTT?TCG?TTT?TC3’，

PCVF?5’GGG?AAT?TCA?ACC?TTA?ATC?TTC?CTT?A?3’

上游引物下劃線為HindIII序列，核酸位置739nt；下游引物下劃線為EcoRI序列，位于423nt。

PCR反應條件為，94℃熱啟動5分鐘，94℃變性60秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，最后72℃延伸10分鐘。擴增產物即為PCV_737-421，經1％瓊脂糖電泳。

1.2ORF2基因氨基端片段在pMD-18T中的克隆