[發明專利]豬圓環病毒2型膠體金抗體快速檢測試紙條的制備方法

無效

• 申請號: 200910014999.4
• 申請日: 2009-05-08
• 公開（公告）號: CN101881770A
• 公開（公告）日: 2010-11-10
• 發明（設計）人: 周順;紀衛寧;崔尚金;李俊;王金寶;袁小遠
• 申請（專利權）人: 青島農業大學;中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所;山東省農業科學院畜牧獸醫研究所
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/558;G01N33/532;G01N33/552;C12P19/34;C12N15/70;C12P21/02;C12R1/19
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 劉德

1.豬圓環病毒2型膠體金抗體快速檢測試紙條的制備方法，其特征在于，利用基因工程表達豬圓環病毒2型ORF2蛋白，采用酶聯免疫原理和膜層析技術制成快速檢測豬血液或血清中的抗體，豬圓環病毒2型膠體金抗體快速檢測試紙條包括樣品墊、結合墊、硝酸纖維膜、吸水墊和PVC板，按照順序固定在PVC板上，PVC板一端依次粘附樣品墊、結合墊，中間粘附硝酸纖維膜，另一端粘附吸水墊，其特征在于結合墊包被了基因工程表達的豬圓環病毒2型ORF2蛋白-膠體金結合物，將表達蛋白包被在硝酸纖維膜作為檢測線(T)，將免抗豬圓環病毒2型抗體包被在硝酸纖維膜作為對照線(C)，制備步驟如下：

一、基因工程表達豬圓環病毒2型ORF2蛋白制備

1)材料和方法：

1.1ORF2基因氨基端737-421nt的擴增：

參照PCV2JXL序列，設計并合成1對引物，以重組質粒pMDT-PCV為模板，擴增ORF2基因的氨基端(737-421nt)部分片段。

CapL?5’AGC?AAG?CTT?CTT?TCG?TTT?TC3’，

PCVF?5’GGG?AAT?TCA?ACC?TTA?ATC?TTC?CTT?A?3’

上游引物下劃線為HindIII序列，核酸位置739nt；下游引物下劃線為EcoRI序列，位于423nt；

PCR反應條件為，94℃熱啟動5分鐘，94℃變性60秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，最后72℃延伸10分鐘，擴增產物即為PCV_737-421，經1％瓊脂糖電泳；

1.2ORF2基因氨基端片段在pMD-18T中的克隆：

將擴增產物PCV_737-421利用膠回收試劑盒大量回收，利用T-A原理，與pMD-18T載體連接，轉化DH5α感受態大腸桿菌，涂布于含有X-gal、IPTG和氨芐青霉素的LB片板，12小時后挑取典型白色單菌落少量培養，提質粒DNA。通過BamHI和EcoRI雙酶切鑒定重組克隆，命名為pMDT-PCV_737-421；

1.3ORF2基因氨基端737-421nt在pGEX-6p-1中的克隆：

原核表達載體pGEX-6p-1是上游帶有谷胱甘肽S轉移酶GST部分基因的高效表達載體，用BamHI和EcoRI雙酶切重組質粒pMDT-PCV_737-421，得到2條條帶，分別為載體2.7kb和插入片段0.3kb，回收其中0.3kb，用BamHI和EcoRI雙酶切pGEX-6p-1，與帶有相同粘端的PCV_737-421連接，轉化大腸桿菌BL21感受態菌，氨芐青霉素抗性篩選，挑取單菌落少量培養基過夜培養，小提質粒DNA，通過限制性內切酶鑒定重組質粒，得到重組克隆命名為pGEX-PCV_737-421；

1.4ORF2基因羧基端421-37nt在pGEX-6p-1中的克隆：

利用pMDT-Cap重組克隆中分別位于引物和載體序列的EcoRI和SalI位點，用EcoRI和SalI雙酶切DNA?pMDT-Cap，得到2條帶，分別為3.0kb和0.4kb，其中3.0kb來自2.7kb的載體帶與ORF2基因的氨基端737-421部分之和，0.4kb條帶，即為ORF2基因的羧基端421-37nt部分PCV_421-37，大量回收，與同樣用EcoRI和SalI雙酶切的pGEX-6p-1載體連接，轉化大腸桿菌BL21感受態菌，常規篩選重組克隆，得到pGEX-PCV_421-37；

1.5pGEX-PCV_737-421和pGEX-PCV_421-37的誘導表達：

按照載體說明書GST?Gene?Fusion?System，第3版進行，將分別含有重組質粒pGEX-PCV_737-421和pGEX-PCV_421-37的新鮮大腸桿菌單菌落在2×YTA培養基中37℃振蕩培養過夜，次日按1％體積比轉接5ml新鮮培養基，37℃繼續培養，當菌液OD₆₀₀值達0.6-0.8時，加入無菌IPTG溶液，使終濃度為0.1mmol/L。誘導3-4小時后停止培養，取1ml離心收集菌體，PBS(pH7.4)洗滌，用80μl?PBS懸浮菌體，與20μl?5×SDS裂解緩沖液混合，煮沸變性5分鐘。利用BioRAD公司的蛋白質電泳裝置進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，分離膠的丙烯酰胺濃度為10％，將只含載體的大腸桿菌同樣誘導做陰性對照，0.25％考馬斯亮蘭染色；

1.6pGEX-PCV_737-421和pGEX-PCV_421-37表達蛋白免疫鼠血清的制備：

分別大量誘導表達上述重組菌，將菌體用原培養液1/10體積的PBS重懸，超聲波破碎至液體清澈，與5×SDS上樣緩沖液煮沸變性5分鐘，進行常規SDS-PAGE，電泳結束后，在考馬斯亮藍染液中染色2小時，再經脫色至背景清晰，用去離子水盡量洗去膠上的脫色液，再置膠于一干凈玻片上，用干凈刀片切下目的條帶，放在1.5ml?EP管中，盡量少混雜無關蛋白，-20℃凍存，免疫前，在冷凍狀態下盡量碾碎膠條，用適量PBS重懸，至膠粒可通過10號注射器針頭為宜，即為制備好的免疫原；

選擇健康活潑的青年雌性BALB/c小鼠，分別腹腔注射上述制備的免疫物質，每只每次0.5ml，每次免疫間隔2-3周，各免疫5只小鼠，2免后每次免疫前框下竇采血約100μl，析血清，對PCV2病毒感染PK15細胞做間接免疫熒光抗體試驗(IFA)，觀察有無特異性熒光染色；

1.7pGEX-PCV_42-37表達蛋白與PCV感染豬多抗血清的ELISA反應性：

將pGEX-PCV_421-37和pPRO-Rep重組菌大量誘導表達后，同上制備免疫原，按常規方法進行ELISA，用碳酸鹽緩沖液pH＝9.6分別以1∶40、1∶80、1∶160、1∶200稀釋后包被酶標板，每個稀釋度3個重復孔，4℃過夜，棄去孔內的液體，同時用洗滌液PBST洗3次，每次5分鐘，拍干，每孔加100μl封閉液37℃封閉2小時，同上洗滌，將PCV2陽性豬血清和分別用PBS按1∶250、1∶500、1∶750、1∶1000、1∶1500稀釋，各稀釋度重復3次，每孔加50μl，同時設SPF豬陰性血清對照和PBS空白對照，37℃作用2小時，洗滌，拍干，加用PBS配制的辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG，每孔50μl，37℃孵育1.5小時，洗滌，拍干，加底物液，每孔加新鮮配制的底物緩沖液50-100μl與9mg鄰苯二胺混合后，臨時加30％H₂O₂0.15ml，37℃靜止10-30分鐘，避光顯色，當陰性孔即將顯色時，以50μl?2mol/LH₂SO₄終止反應，在酶聯免疫閱讀儀上492nm波長下讀取OD值，結果判定：若陰性對照孔無色或接近無色，陽性對照孔明確顯色，則直接用肉眼觀察結果；

2)制備兔豬圓環病毒2型高免血清

用豬圓環病毒2型抗原，采用多點注射法免疫陰性家兔3只，每隔2周加強免疫1次，共進行3次，最后一次免疫10天后采血，分離血清，純化后得兔抗豬圓環病毒2型IgG；

3)膠體金顆粒制備

將氯化金配制成0.01％水溶液，取100ml煮沸2min后，邊攪拌邊加入1％檸檬酸三鈉2ml，煮沸至溶液顏色變成酒紅色后，繼續煮沸至適宜濃度OD₅₃₅＝0.9312，冷卻后加入雙蒸餾水恢復到原體積，置4℃保存；

4)膠體金標記ORF2蛋白制備及純化

將待標記蛋白倍比稀釋，分別取100μl加入1ml膠體金中，10min后加入10％NaCl?100μl，4℃靜止1h。取膠體金顏色沒有發生改變的最高稀釋倍數為準，在此基礎上加30％為最佳標記量，取一定量調配好的膠體金用0.2mol/L?K₂CO₃調至pH＝9.0，按最佳標記量加入表達抗原，室溫作用20min，加入Tris-HCl(pH?8.0，20mmol/L)配制的BSA，使終濃度為1％，4℃放置2h后使用。將金標抗原3000r/min離心30min，取上清，60000g離心60min，沉淀用0.02mol/L?pH7.2含0.1％BSA的PBS溶解，恢復到原體積。再超離1次，沉淀用少許上述PBS溶解，使OD₅₃₅nm＝1.5。0.22μm濾膜過濾，4℃保存備用；

5)試紙條的組成

用噴膜機將膠體金標記蛋白復合物噴涂在膠體金結合墊上，將表達ORF2蛋白和兔抗豬圓環病毒2型IgG依次間隔4mm噴在硝酸纖維膜NCM上，分別作為檢測帶和質控帶，將包被好的NCM放入含3％BSA的pH7.2，0.01M?PBS中，過夜，封閉其余蛋白結合位點，倒掉封閉液，用pH7.2，0.01M?PBS，洗2次，每次5min，37℃干燥1h備用，將硝酸纖維膜、膠體金結合墊、樣品墊、吸水墊等一次粘在PVC板上，即，將玻璃纖維連接在NCM上端，邊緣并附著在NCM上；棉漿墊附著在玻璃纖維上，與NCM銜接；吸水濾紙板連接在NCM下端，邊緣并附著在NCM上，將粘好的PVC材料切成60mm長、4mm寬的試紙條，即制成豬圓環病毒2型膠體金抗體快速檢測試紙條，將試紙條密封于鋁箔袋中，4℃保存；

6)擴增核苷酸序列

由于PCV_737-421片段是通過PCR擴增得來，分析測序結果是重組DNA的最大讀碼框覆蓋了整個序列，中間未出現無義突變，與親本毒JXL株同源性達100％，因此核苷酸序列表示如下，起始密碼子ATG以斜線表示：

PCV_737-421：

BamHI

GGATCCGATATGACGTATCTAAGGAGGCGTTACCGGAGAAGAAGACACCGCCCCCGCAGCCATCTTGGCCAGATCCTCCGCCGCCGCCCCTGGCTCGTCCACCCCCGCCACCGTTACCGCTGGAGAAGGAAAAATGGCATCTTCAACACCCGCCTCTCCCGCACCTTCGGATATACTATCAAGCGAACCACAGTCAAAACGCCCTCCTGGGCGGTGGACATGATGAGATTCAATATTAATGACTTTCTTCCCCCAGGAGGGGGCTCAAACCCCCGCTCTGTGCCCTTTGAATACTACAGAATAAGGAAGATTAAGGTTGAATTC

EcoRI。

2.豬圓環病毒2型膠體金抗體快速檢測試紙條，其特征在于，包括吸水墊、硝酸纖維膜、含有膠體金標記抗原的玻璃纖維膜、金標抗原保護膜、反應支持物PVC板，其中，硝酸纖維膜設置在反應支持物PVC板的中間，硝酸纖維膜上設置有兩個顯色區T和C，其中T區中包被有基因工程豬偽狂犬表達gE蛋白；C區包被有兔抗豬偽狂犬IgG，在硝酸纖維膜T區的左端部上表面，設置有含有膠體金標記抗原的玻璃纖維膜，含有膠體金標記抗原的玻璃纖維膜上表面設置有金標抗原保護膜，硝酸纖維膜的右端C區的上表面設置有吸水墊。