[發明專利]鑒定太平洋牡蠣種群的新方法

無效

• 申請號: 200910013114.9
• 申請日: 2009-08-11
• 公開（公告）號: CN101613741A
• 公開（公告）日: 2009-12-30
• 發明（設計）人: 仇雪梅;劉少貞;徐麗;王秀利;柳曉瑜
• 申請（專利權）人: 大連水產學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N27/447
• 代理公司: 大連科技專利代理有限責任公司
• 代理人: 于忠晶

技術領域：

本發明涉及一種新的快速準確鑒定牡蠣種群的方法。

背景技術：

牡蠣的貝殼可塑性強，貝殼外部形態差異極大，研究人員積極尋求其它研究手段，以求解決牡蠣分類中存在的疑難問題。大部分學者認為牡蠣軟體部的結構差異很小，可提供的分類證據少。絕大多數的牡蠣具有恒定的染色體數目(2n＝20)，并且核型的差異甚微，無法為區別牡蠣物種提供證據(參見Ahmed?M.Cytogenetics?of?oysters.Cytologia，1973，28：337-346.)。在借助生化手段方面，蛋白質和同工酶電泳技術被用于研究屬間的遺傳多樣性分析以及對分布區重疊的種群間的種類鑒定，但電泳分析結果應用于種類鑒別上的有效性，尚存在諸多爭議(參見HedgecockD，Okazaki?N?B.Genetic?diversity?within?and?between?population?ofAmerican?oyster(Crassostrea).Malacologia，1984，25：535-549.)。此外，地理分布常是牡蠣物種鑒定的主要依據之一，但有不少研究表明，一些具有不同地理分布而被界定為不同種的牡蠣，很容易雜交，產生可存活的并且具有繁育能力的后代(參見Gaffney?P?M，Allen?S?KJr.Hybridization?among?Crassostrea?species：a?criticalreviews.Aquaculture，1993，116：1-13.)。因此，由于缺少有效的鑒定種群的方法，在相當長的一段時期內，牡蠣的種名混亂，同物異名和異物同名等現象十分嚴重。

此外異地引種養殖頻繁，打破了牡蠣種間的地理隔離，對我國的牡蠣種質資源造成了嚴重的影響，進一步加劇了現有牡蠣形態分類的難度。分類方面的混亂已嚴重影響到牡蠣的養殖和育種，給雜交育種工作的開展帶來了諸多不便。

微衛星最早應用之一是制作DNA指紋圖來進行個體、品種(系)鑒定。2006年，D.Lallias等人用微衛星分子標記技術首次繪制出歐洲牡蠣的遺傳圖譜(參見D.Lallias，A.R.BeaumontSchool?of?Ocean?Sciences，College?of?Natural?Sciences，University?of?Wales，Bangor，MenaiBridge，Gwynedd，LL595AB，UK.A?first-generation?genetic?linkagemap?of?the?European?flat?oyster?Ostrea?edulis(L.)based?on?AFLP?andmicrosatellite?markers[J].Mol?Ecol.2006，15(13)：29-42.)

現中國養殖的主要經濟牡蠣太平洋牡蠣，為了更好的準確鑒定牡蠣種群和順利地進行遺傳育種工作，迫切需要一種省時準確的方法，從而達到保護牡蠣資源的目的。

發明內容：

本發明的目的是解決牡蠣種質鑒定和遺傳育種存在的不足問題，提供一種鑒定太平洋牡蠣種群的新方法，應用EST-SSRs分子標記技術，從不同種群牡蠣(褶牡蠣，近江牡蠣，太平洋牡蠣等)中分離出太平洋牡蠣群體，方法簡單，分析準確。

本發明為實現上述目的采用的技術方案是：鑒定太平洋牡蠣種群的新方法，

1)樣本采集：分別采集褶牡蠣、太平洋牡蠣和近江牡蠣不同的種群樣本個體；

2)基因組提取：提取上述樣本每種牡蠣群體的多個樣本的基因組；

3)引物設計：根據含有微衛星的EST序列設計EST-SSRs引物；

4)PCR擴增：利用EST-SSRs引物進行PCR擴增，得到目的片段的PCR產物；

5)EST-SSRs特異位點的鑒定：對PCR產物先進行瓊脂糖凝膠電泳，得到具有清晰且穩定條帶的PCR產物，再進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，進行多態性位點檢測，鑒定出具有特異的EST微衛星序列的等位基因位點太平洋牡蠣種群。

所述樣本采集：分別選取褶牡蠣、太平洋牡蠣、近江牡蠣各40以上個體，每個牡蠣取其閉殼肌0.1克放入1.5ml離心管中，加入95％乙醇后放入-20℃冰箱中保存備用。

所述基因組提取：參照薩姆布魯克等經典酚-仿抽提法從牡蠣肌肉中提取牡蠣的全基因組DNA(參見薩姆布魯克J，弗里奇EF，蔓尼阿蒂斯T，著.分子克隆實驗指南[M].金冬雁，黎孟楓，侯云德，等譯.第2版.科學出版社.1992，63-481.)。