[發(fā)明專利]鑒定太平洋牡蠣種群的新方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910013114.9
• 申請日: 2009-08-11
• 公開（公告）號(hào): CN101613741A
• 公開（公告）日: 2009-12-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 仇雪梅;劉少貞;徐麗;王秀利;柳曉瑜
• 申請（專利權(quán)）人: 大連水產(chǎn)學(xué)院
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;G01N27/447
• 代理公司: 大連科技專利代理有限責(zé)任公司
• 代理人: 于忠晶

1、鑒定太平洋牡蠣種群的新方法，其特征是：

1)樣本采集：分別采集褶牡蠣、太平洋牡蠣和近江牡蠣不同的種群樣本個(gè)體；

2)基因組提取：提取上述樣本每種牡蠣群體的多個(gè)樣本的基因組；

3)引物設(shè)計(jì)：根據(jù)含有微衛(wèi)星的EST序列設(shè)計(jì)EST-SSRs引物；

4)PCR擴(kuò)增：利用EST-SSRs引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到目的片段的PCR產(chǎn)物；

5)EST-SSRs特異位點(diǎn)的鑒定：對PCR產(chǎn)物先進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，得到具有清晰且穩(wěn)定條帶的PCR產(chǎn)物，再進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，進(jìn)行多態(tài)性位點(diǎn)檢測，鑒定出具有特異的EST微衛(wèi)星序列的等位基因位點(diǎn)太平洋牡蠣種群。

2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定太平洋牡蠣種群的新方法，其特征是：樣本采集：分別選取褶牡蠣、太平洋牡蠣、近江牡蠣，每個(gè)牡蠣取其閉殼肌放入1.5ml離心管中，加入95％乙醇后放入-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定太平洋牡蠣種群的新方法，其特征是：基因組提取：采用經(jīng)典酚-仿抽提法從牡蠣肌肉中提取牡蠣的全基因組DNA。

4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定太平洋牡蠣種群的新方法，其特征是：EST-SSRs引物設(shè)計(jì)：從NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的EST庫中搜索太平洋牡蠣的EST序列，然后用在線軟件SSRIT(http://www.gramene.org/db/markers/ssrtool)找出含有微衛(wèi)星的EST序列，根據(jù)這些含有微衛(wèi)星的EST序列利用在線引物設(shè)計(jì)軟件Premier3.0(http://frodo.wi.mit.Edu/cgibin/primer3/primer3_www.cgi)設(shè)計(jì)EST-SSRs引物，引物設(shè)計(jì)主要參數(shù)為：引物長18-22bp，最適20bp；引物退火溫度55-65℃，上下引物之間退火溫度不超過5℃；GC含量40％-60％，最適50％；PCR預(yù)期產(chǎn)物長150-300bp。

5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定太平洋牡蠣種群的新方法，其特征是：EST-SSRs引物設(shè)計(jì)：設(shè)計(jì)適用于太平洋牡蠣的引物序列：

F--------5’GCAGAGATGGTCTGGAAAGC??3’

R---------5’CTGGCTGGAGAAGAACAAGG??3’。

6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定太平洋牡蠣種群的新方法，其特征是：EST-SSRs的PCR擴(kuò)增：以提取的全基因組DNA樣品分別為模板，對EST-SSRs引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

7、根據(jù)權(quán)利要求1-6任一所述的鑒定太平洋牡蠣種群的新方法，其特征是：EST-SSRs特異位點(diǎn)的鑒定：首先經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳，得到擴(kuò)增條帶穩(wěn)定、條帶清晰的PCR產(chǎn)物；再進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，擴(kuò)增條帶穩(wěn)定、條帶清晰且有多態(tài)性的EST-SSRs引物即是太平洋牡蠣群體。