[發明專利]一種檢測細胞損傷修復能力的方法及其專用芯片

無效

• 申請號: 200910012405.6
• 申請日: 2009-07-08
• 公開（公告）號: CN101586075A
• 公開（公告）日: 2009-11-25
• 發明（設計）人: 秦建華;張敏;林炳承;李艷峰
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C12M1/34
• 分類號: C12M1/34;C12Q1/02
• 代理公司: 沈陽晨創科技專利代理有限責任公司
• 代理人: 張 晨

技術領域

本發明涉及細胞損傷修復測定技術，特別提供了一種檢測細胞損傷修復能力的方法及其專用芯片。

背景技術

生物體生存的環境是一個不斷變化的、存在細菌、病毒、過敏原等多種致病因素的環境。連續的細胞層在病理因素的持續作用下易于受損，細胞脫落形成缺損，而受損后的組織重建和功能重建過程則依賴于細胞的損傷修復能力。損傷修復的過程首先是傷口周圍細胞向傷口部位發生極化，并伸出突觸，然后細胞開始遷移增殖并逐步愈合傷口。上述過程無論在整個組織還是在單個細胞水平上都是類似的。損傷修復實驗已經被作為研究細胞極化、組織基質重排、預測細胞在不同細胞和不同培養環境下細胞的增殖及遷移能力的重要手段。臨床上，細胞損傷修復能力的下降是胃、十二指腸潰瘍、氣道高反應性、血栓形成等眾多病理過程發生發展的重要因素，而提高細胞損傷修復的能力也是許多細胞因子、神經遞質以及藥物發揮作用的重要途徑。對于細胞損傷修復能力的考察也是細胞學研究常用實驗之一。

傳統的損傷修復分析按照造成缺損的方法分為機械損傷和化學損傷兩種，實際應用中以劃痕法為主，即在體外培養的單層細胞上采用機械刮擦的方法形成物理刮痕，然后使用顯微鏡觀察相應時間段內劃痕的愈合情況，具體的愈合時間隨不同的細胞類型、培養條件以及傷口的區域大小而變化。劃痕法依賴于手工操作，其傷口區域的大小及寬度變化較大，初始損傷面積不易控制，拍照時缺損難以準確定位，而且劃痕可能會對周圍的細胞造成損傷從而影響其遷移的效率，因此這種“劃痕”傷口愈合試驗結果由于細胞間相互的多因素作用而不夠理想，往往導致實驗重復性不佳，更為重要的是，在實際應用中，這種定性的觀察(而非定量測量)難以被應用到高通量的研究中。因此，開發操作簡便、缺損一致、拍照方便、通量高的損傷修復定量檢測方法，已成為實驗室技術發展的必然。

微流控芯片實驗室又稱芯片實驗室(Lab-on-a-Chip)或微流控芯片(Microfluidic)，指的是把化學和生物等領域中所涉及的樣品制備、反應、分離、檢測、細胞培養、分選、裂解等基本操作單元集成或基本集成到一塊幾平方厘米(甚至更小)的芯片上，由微通道形成網絡，以可控流體貫穿整個系統，用以取代常規化學或生物實驗室的各種功能的一種技術。由于微流控芯片的多維網絡特征和功能集成特征，已經有可能使常規的細胞培養、細胞受激、細胞標記和檢測等過程集成在一塊很小的芯片上完成。因此，微流控芯片技術與細胞損傷修復檢測方法發展的需求相吻合，有望成為損傷修復新檢測方法的突破口。

發明內容

本發明的目的是提供了一種檢測細胞損傷修復能力的方法及其專用芯片。

本發明提供了一種集成化微流控芯片，該芯片由2～99個相同的細胞培養結構單元構成，這些結構單元之間通過一個公共細胞進樣池相連接；每個結構單元含有2～99個柱形結構、2～99個擋板結構和一個廢液池。

本發明提供的集成化微流控芯片，所述的柱形結構大小和形狀均相同，柱形結構之間間隔相同的距離，沿細胞進樣通路兩側均勻分布；柱形結構的作用是形成相同的細胞缺損區，缺損區大小在顯微鏡拍照視野內。

本發明提供的集成化微流控芯片，所述的擋板結構由2～99個板狀結構組成，主要起分流作用，使細胞在灌注時均勻分布于柱形結構周圍。

本發明還提供了一種利用集成化微流控芯片進行檢測細胞損傷修復能力的方法，方法過程為：將細胞懸液加入位于芯片中央的公共細胞進樣池中，靜置5-30分鐘，芯片置于顯微鏡下觀察，當芯片中細胞不再流動停駐于細胞培養室中時，加入細胞培養基，使其液面略高于芯片高度；將接種了細胞的微流控芯片放入細胞培養箱中培養，然后將芯片置于顯微鏡下觀察細胞的貼壁及生長情況；待細胞貼壁且細胞密度大于80％后，輕輕將微流控芯片揭去，分別加入含不同藥物的細胞培養基，立即在顯微鏡下尋找損傷區域并拍照；拍照后繼續放置于培養箱中培養，其后每隔4～12小時對缺損區拍照一次，連續動態觀察24～72小時；收集所有時間點的缺損區域圖像，采用圖像分析軟件勾畫缺損邊緣并測算缺損面積，以0h缺損面積為百分之百，計算各時間點缺損面積占0h缺損面積的百分比，以反映缺損愈合情況；繪制時間與缺損面積的直線回歸圖，作出直線回歸方程，Y＝a+bX，損傷修復指數(Wound?repair?index，RI)等于回歸方程中b的絕對值，即RI＝|b|，以此反映不同處理組中細胞愈合速度的快慢。

本發明具有如下優點：