[發明專利]人工活體冷凍提取組織超微結構及其蛋白分布標本的方法

無效

• 申請號: 200910012016.3
• 申請日: 2009-06-15
• 公開（公告）號: CN101919715A
• 公開（公告）日: 2010-12-22
• 發明（設計）人: 李子龍
• 申請（專利權）人: 李子龍
• 主分類號: A61B10/02
• 分類號: A61B10/02
• 代理公司: 沈陽亞泰專利商標代理有限公司 21107
• 代理人: 史旭泰

技術領域：

本發明涉及醫用組織結構檢測標本提取的方法，特別是涉及一種應用“活體冷凍技術-IVCT”人工提取活體器官組織超微結構及蛋白分布標本的方法。

背景技術：

上世紀九十年代末，Ohno?S等建立了“活體冷凍技術”(in?vivocryotechnique-以下簡稱：IVCT)的理論和方法。即：在活體冷凍裝置VI-11；Eiko?Engineer?Co.Ibaraki，Japan)上，采用異戊烷-丙烷混合冷凍劑，在-193℃下結合液態氮和冷凍置換等方法，瞬間捕獲活體鼠腎臟超微組織結構標本的方法。采用此項技術提取的活體鼠腎臟內的所有生物進程被即刻停止，隨后進行冷凍置換；此時結構組織中的水分子幾乎同時凍結，形成無數個極小的冰晶(約20nm³)，達到無定形微晶態或玻璃態，不會對細胞和組織造成傳統方法制取的損傷，能夠原位保持其所有的結構與成分，并在含有固定液的無水有機溶液中使已冷凍的細胞和組織內的某些物質成分被快速交聯，限制可溶性分子的彌散，原位保留了某些暴露的抗原位點。冷凍速度快(幾毫秒～1秒)，能夠捕捉細胞結構瞬間完成的生理過程，并以大于10⁴K/s的冷凍速率將生物組織固化至玻璃態或近似玻璃態，使生物組織的超微組織結構和各種組份得到可信的保存。一定厚度的組織(約20-30μm)用IVCT冷凍固定法在1ms左右的時間內能夠被完全固定，其超微組織結構能得到極佳的保存。之后的冷凍置換可以從-80℃(以往置換環境是-25℃)，開始逐漸置換組織標本中的水分子，此時標本的生理活動基本上是處于停止狀態，隨著溫度的上升，置換標本中水分子的速度加快，當標本的生理活動隨著溫度的上升開始恢復時，標本中水分已經減少許多；溫度上升至-20℃時，低溫置換的有機溶劑中所含的固定成分開始對標本進行二次固定和進一步脫水，直至標本溫度上升至室溫，固定和脫水過程完成。IVCT結合冷凍置換使標本生理活動被迅速固定的同時不會在后續的脫水過程中有所改變，制備的標本更符合其活體時的生理狀態。

而傳統的形態學人工采取的組織結構標本，是經過浸入的標本快速冷凍并結合臨界點干燥法提取標本。如浸入固定或組織切割后快速冷凍，制取標本時均需將組織結構切割形成離體狀態，其過程通常需要數十秒或數分鐘，不可避免的造成活體的心臟停跳、血液循環停止的情況，形成人為的缺血、缺氧，很可能影響組織細胞結構形態、蛋白分布和分子構象，很難提取到快速改變細胞結構標本；提取標本后的固定，一般采用浸入常溫或4℃固定劑中，或直接用固定劑灌流固定，一方面在上述溫度下組織細胞的生理活動可能未完全停止，另一方面固定劑的交聯也需要一定時間，而這期間可溶性成分可能發生改變，使組織和細胞變性，破壞他們的超微組織結構，都可能影響到真實反映活體狀態下組織細胞組織結構的生理病理情況；繼而的臨界點干燥法中，在組織溶劑里、室溫條件下，采取的快速干燥過程，也常導致標本組織結構皺縮和滲透性發生改變，臨界點干燥法也會不可避免的伴有人為操作等問題。因此，傳統標本制備方法易引起細胞基質丟失和超微組織結構改變。

另外，采用化學固定提取標本的方法，是通過化學固定劑與標本中的蛋白質等成份交聯成穩定的凝膠，使標本中的一些組份和結構固定下來。化學固定劑如戊二醛、多聚甲醛、鋨酸等，與細胞和組織內分子的交聯作用需要一定的時間，這期間可溶性成分可能發生改變，組織和細胞可能變性，會引起超微組織結構發生變異，從而不能真實反映活體狀態下自身的生理病理狀況，進而對正確分析細胞組織結構等帶來一定的困難。

綜上所述，與化學和傳統提取標本的方法相比較，IVCT在保持活體器官正常生存、血液循環存在的條件下，即刻冷凍標本保存了具有功能意義的細胞、組織及其內在所有生物學成分的原貌形態學和功能狀態。相比之下，IVCT可減少從提取標本、固定到脫水過程中產生的形態學改變，極大程度保存了真實的超微組織結構，減少了人為因素造成的影響。

采用的先進提取活體組織結構標本的方法，結合當前應用的很多檢測技術如HE染色、免疫染色、免疫組化染色，以及熒光探針等，通過各種光學顯微鏡、共聚焦顯微鏡和電子顯微鏡技術，顯示了活體內生物成分的原始結構和細胞內定位、功能細胞的原始形態學，已成為檢驗活體器官原始功能形態結構及對高度時間分辨率和時間依賴的細胞和組織結構內動態的生物成分進行分析的良好方法。