[發明專利]銀屑病基礎研究模型的建立方法及氣液平面跨膜裝置

無效

• 申請號: 200910011891.X
• 申請日: 2009-06-05
• 公開（公告）號: CN101570739A
• 公開（公告）日: 2009-11-04
• 發明（設計）人: 劉曉明;王曼姬
• 申請（專利權）人: 劉曉明
• 主分類號: C12N5/08
• 分類號: C12N5/08;C12M3/02;C12Q1/02
• 代理公司: 大連東方專利代理有限責任公司
• 代理人: 李 猛

技術領域

本發明屬于實驗模型的建立領域。

背景技術

隨著對銀屑病越來越深入而廣泛的研究探索，作為實驗基礎的銀屑病體 外模型一直是學術界關注的熱點。一方面，人們致力于銀屑病鼠模型的研究： 早在上世紀60年代起人們便已經開始利用紫外線、化學制劑誘發建立小鼠 銀屑病模型。然而，該模型僅僅模擬了銀屑病的某種特定病理，并且存在著 維持時間短暫的缺陷。

70年代Krueger等首次成功將人銀屑病皮損移植到裸鼠上，但Baker等 對移植皮膚進行評估，發現大多數銀屑病特征在移植后不能長久維持，同時 因鼠機體本身可提供細胞因子，影響實驗效果。長久維持，同時因鼠機體本 身可提供細胞因子，影響實驗效果。

近年來人們致力于研究自發性動物模型，如無毛突變鼠、鱗狀皮膚突變 鼠，但價格昂貴，存在人工定向性；此外Bonder等利用雌激素期增生的小 鼠陰道上皮和Jarrett利用鼠尾鱗片表皮進行藥物療效的研究，但只能模擬 銀屑病的表皮過度增殖和表皮分化不全，不能全面反應銀屑病的病理改變， 特別是T細胞相關的異常。

另一方面，隨著分子生物學技術的進展，人們試圖應用多種細胞體外聯 合培養的方法構建組織工程模型，但因技術復雜、費用昂貴而適用性不強。

發明內容

基于上述原因，我們致力于完全模擬人體銀屑病可能的發病機制，體外 培養銀屑病皮損，建立一種經濟簡便實用的銀屑病體外仿真模型，用于銀屑 病的基礎、實驗室及臨床研究。

本發明的技術構思為：利用銀屑病鏈球菌誘導機制及T細胞介導過度增 殖的機制，創新性的采用①加入銀屑病外周血T淋巴細胞及②溶血性鏈球菌 抗原的無血清培養基，體外培養銀屑病皮損。可維持銀屑病皮損特征性組織 形態長達一周之久。

本發明是通過以下技術手段得以實施的：

一、一種銀屑病基礎研究模型的建立方法

1.取材：

①皮膚標本：半年內未經治療尋常性銀屑病皮損；

②銀屑病外周血：相應銀屑病患者外周血2mL，無菌真空抗凝采血管采集， 血樣和所有皮膚標本的采集均征得患者知情同意并經倫理委員會批準；

③β-溶血性鏈球菌。

2.材料處理及運輸

將大小約1.5cm×1.5cm的未經治療尋常性銀屑病皮損，除去皮脂及部分 真皮，放入含10％青霉素、鏈霉素的William’s培養基200ul的1.5mL離 心管，4℃30min內運至實驗室；血樣37℃30min內運至實驗室。

3.T淋巴細胞分離

將相應的銀屑病患者外周血2mL，與PBS體積比1∶1混勻，小心加于4mL 淋巴細胞分離液上，1500轉/分離心20min，取上數第二層環狀乳白色淋巴 細胞層，PBS洗滌兩次，24孔板培養，利用粘附貼壁分離法，去除單核細胞 和部分B淋巴細胞，收集懸浮細胞，密度10⁶個/mL于William’s培養基培 養。

4.β-溶血性鏈球菌抗原制備

將β-溶血性鏈球菌于哥倫比亞血平板中37℃培養24小時。平板菌落計 數法計數，密度10⁹個/m，培養液12000轉/分離心，菌體沉淀收集后置雙蒸 水中，冰浴，40W×8分三次超聲打散沉淀液細菌，25000轉/分離心收集散 菌菌體沉淀，稱重，-20℃保存備用。

5.簡易皮膚組織氣液培養模型制備

無菌六孔板，每孔滴入2mL?William’s培養基，放置經滅菌處理的直 徑為2cm圓形擦鏡紙于其上。體外銀屑病皮損自制簡易培養皿如圖1。

6.皮塊處理

在超凈臺內將皮損均勻切成3mm×3mm皮塊，用含10％雙抗的PBS洗滌3 次，每次2min，輕放于準備好的培養裝置的承載面上，表皮暴露于空氣中， 真皮處于液相中。加入銀屑病外周血T淋巴細胞、β-溶血性鏈球菌抗原的 William’s培養基，于37℃，CO₂飽和度為5％孵育箱中培養，隔日換液。

步驟2中所述的未經治療尋常性銀屑病皮損，是在無菌操作下取得的。

有益效果

使用以上方法制備的模型具備以下特點：

(1)采用無血清培養，不會受到普通動物血清制品中細胞因子及其他化 學制劑的干擾，純化了培養環境；