[發明專利]一種檢測2-酮基-L-古龍酸中蛋白質含量的方法

有效

• 申請號: 200910011356.4
• 申請日: 2009-04-29
• 公開（公告）號: CN101566575A
• 公開（公告）日: 2009-10-28
• 發明（設計）人: 于霞;王雪;李春杰;陳宏權;敖志剛;董靜;董淑清;符艷君;王鳳杰;王彥春
• 申請（專利權）人: 東北制藥總廠
• 主分類號: G01N21/78
• 分類號: G01N21/78;G01N21/31
• 代理公司: 沈陽智龍專利事務所(普通合伙)
• 代理人: 宋鐵軍

一、技術領域；

本發明涉及一種化學分析方法，特別是一種運用考馬斯亮藍比色法測定2-酮基-L-古龍酸中蛋白質含量的分析方法。

二、背景技術；

維生素C又名L-抗壞血酸，是人體營養必需的維生素，用途非常廣泛，常被用于食品、飼料及化妝品中，在醫藥和臨床上亦有廣泛應用，在國際醫藥貿易中長期占十分重要的地位。其主要的生產方法是萊氏法和兩步發酵法。兩步發酵法是我國首創，它是以生物氧化過程代替萊氏路線的部分化學合成過程，進而合成維生素C。

兩步發酵法是以D-山梨醇為原料，經黑醋菌和假單孢菌兩步發酵得到維生素C的重要中間體2-酮基-L-古龍酸鈉發酵液。發酵液的提取工藝是維生素C生產行業中較為重視的問題，兩步發酵后，發酵液的含量低，且殘留有菌絲體、蛋白質和懸浮微粒等，其中蛋白質的存在對分離提純帶來了困難，并嚴重影響到2-酮基-L-古龍酸干品質量，對后續維生素C轉化工藝也帶來了嚴重影響。過去從來沒有2-酮基-L-古龍酸蛋白質含量的測定方法。

生產中除蛋白質的方法有絮凝法、超濾膜、陶瓷膜，但是這些方法截流蛋白如何，由于沒有合適檢測蛋白的方法，一時無法客觀評價，因為沒有2-酮基-L-古龍酸蛋白質含量的測定方法，所以在生產實踐中幾乎只能完全憑借經驗處理。因此，建立科學、準確、方便、快速的一種檢測2-酮基-L-古龍酸中蛋白質含量的方法，對保證和指導正常生產具有重大的意義。

目前常用的幾種經典的蛋白質的定量檢測方法有凱氏定氮法、雙縮脲法和紫外吸收法。凱氏定氮法是目前有機化合物含氮量常用的方法，但此法要求特制玻璃儀器，操作時間長、復雜，產生毒氣；雙縮脲法蛋白檢測迅速，主要缺點靈敏度差；紫外吸收法不適于有色物質的檢測。

近年出現了BCA法和考馬斯亮藍比色法，BCA法檢測靈敏度很高，但是受雜質影響大，主要影響雜質包括具有還原性的醇和糖。考馬斯亮藍比色法檢測過程簡單、迅速，適于檢測微量蛋白含量。

生產中的2-酮基-L-古龍酸發黃，溶液顏色很難處理掉，蛋白含量微量，干擾物質多，包括含氮物質尿素、還原性的山梨醇、山梨糖，并且2-酮基-L-古龍酸本身也具有還原性。針對2-酮基-L-古龍酸上述特征，選用考馬斯亮藍法檢測2-酮基-L-古龍酸中的蛋白含量，并對檢測條件進行優化。

三、發明內容；

本發明提供一種檢測方法，其目的在于解決目前無法對2-酮基-L-古龍酸中蛋白質含量進行檢測方面所存在的問題。

一種檢測2-酮基-L-古龍酸中蛋白質含量的方法，其特征在于具體步驟如下：

(1)配制磷酸鹽緩沖液(pH7.0)：取磷酸二氫鉀加氫氧化鈉溶液配置pH為7.0的磷酸鹽緩沖液，用水稀釋至100m；

(2)配制0.1mg/mL牛血清蛋白質標準溶液：稱取牛血清蛋白，用少量蒸餾水溶解定容至100mL，得到1mg/mL蛋白質溶液，移取10mL此蛋白溶液定容至100mL容量瓶，加入10ml步驟(1)的磷酸鹽緩沖液，去離子水定容，即得0.1mg/mL蛋白質標準液，冰箱中保存，待用；

(3)配制考馬斯亮藍G-250染色劑，0.1g考馬斯亮藍G-250，50ml?95％乙醇，100ml?85％磷酸，用水定容至1L；冰箱中保存，待用；

(4)配制0.02、0.04、0.06、0.08.、0.1mg/ml的牛血清蛋白質標準溶液，分別移取1ml的牛血清蛋白質標準溶液至5支試管中，加入5ml考馬斯亮藍G-250染色劑，制作595nm處考馬斯亮藍G-250與蛋白質結合后吸光度增加值(ΔA₍₅₉₅₎)與蛋白質濃度(c，mg/mL)關系標準曲線；

(5)供試品溶液的配制：

①2-酮基-L-古龍酸干品：稱取5g?2-酮基-L-古龍酸干品，用去離子水將其溶解至100ml容量瓶，再加入6.5ml?20％KOH稀堿溶液和10mlpH為7的緩沖溶液，調節供試品pH，去離子水定容；

②2-酮基-L-古龍酸鈉醪液：2000r/min離心20min，移取上清液2ml至試管中，然后加入2ml40％KOH稀堿溶液，沸水中煮30min，去離子水將其洗入100ml容量瓶，再加入4.5ml20％硝酸溶液和10ml?pH為7的緩沖溶液，調節供試品pH，去離子水定容；

(6)測定2-酮基-L-古龍酸中蛋白質含量：