[發明專利]一種檢測2-酮基-L-古龍酸中蛋白質含量的方法

有效

• 申請號: 200910011356.4
• 申請日: 2009-04-29
• 公開（公告）號: CN101566575A
• 公開（公告）日: 2009-10-28
• 發明（設計）人: 于霞;王雪;李春杰;陳宏權;敖志剛;董靜;董淑清;符艷君;王鳳杰;王彥春
• 申請（專利權）人: 東北制藥總廠
• 主分類號: G01N21/78
• 分類號: G01N21/78;G01N21/31
• 代理公司: 沈陽智龍專利事務所(普通合伙)
• 代理人: 宋鐵軍

1.一種檢測2-酮基-L-古龍酸中蛋白質含量的方法，其特征在于具體步驟如下：

(1)配制磷酸鹽緩沖液：取磷酸二氫鉀加氫氧化鈉溶液配置pH為7.0的磷酸鹽緩沖液，用水稀釋至100ml；

(2)配制0.1mg/ml牛血清蛋白質標準溶液：稱取牛血清蛋白，用少量蒸餾水溶解定容至100ml，得到1mg/ml蛋白質溶液，移取10mL此蛋白溶液定容至100mL容量瓶，加入10ml步驟(1)的磷酸鹽緩沖液，去離子水定容，即得0.1mg/mL蛋白質標準液，冰箱中保存，待用；

(3)配制考馬斯亮藍G-250染色劑，0.1g考馬斯亮藍G-250，50ml?95％乙醇，100ml?85％磷酸，用水定容至1L；冰箱中保存，待用；

(4)配制0.02、0.04、0.06、0.08、0.1mg/ml的牛血清蛋白質標準溶液，分別移取1ml的牛血清蛋白質標準溶液至5支試管中，加入5ml考馬斯亮藍G-250染色劑，制作595nm處考馬斯亮藍G-250與蛋白質結合后吸光度增加值與蛋白質濃度關系標準曲線；

(5)供試品溶液的配制：

①2-酮基-L-古龍酸干品：稱取5g?2-酮基-L-古龍酸干品，用去離子水將其溶解至100ml容量瓶，再加入6.5ml?20％KOH稀堿溶液和10mlpH為7的緩沖溶液，調節供試品pH，去離子水定容；

②2-酮基-L-古龍酸鈉醪液：2000r/min離心20min，移取上清液2ml至試管中，然后加入2ml40％KOH稀堿溶液，沸水中煮30min，去離子水將其洗入100ml?容量瓶，再加入4.5ml20％硝酸溶液和10ml?pH為7的緩沖溶液，調節供試品pH，去離子水定容；

(6)測定2-酮基-L-古龍酸中蛋白質含量：

分別移取1ml去離子水一份和供試品溶液兩份于三支試管中，前兩支試管加入5ml考馬斯亮藍試劑，第三支試管加入5ml去離子水，120min內分別測定三支試管中的溶液和去離子水在595nm處吸光度；吸光度的增加量ΔA₍₅₉₅₎＝A₂-A₁-A₃+A₀，其中A₀為去離子水的吸光度，A₁為1ml去離子水和5ml考馬斯亮藍G-250溶液的吸光度，A₂為1ml供試品和5ml考馬斯亮藍G-250溶液的吸光度，A₃為1ml供試品和5ml去離子水的吸光度；根據吸光度增加值與蛋白質濃度標準曲線斜率得出2-酮基-L-古龍酸中蛋白質含量。

2.一種根據權利要求1所述的檢測2-酮基-L-古龍酸中蛋白質含量的方法，該方法用于2-酮基-L-古龍酸醪液到2-酮基-L-古龍酸干品的整個過程中的蛋白質檢測。

3.根據權利要求1所述的一種檢測2-酮基-L-古龍酸中蛋白質含量的方法，其特征在于步驟(4)所述的595nm處吸光度增加值與蛋白質濃度關系標準曲線的繪制，每配制一次考馬斯亮藍G-250染色劑，就需要重新繪制595nm處吸光度增加值與蛋白質濃度關系標準曲線。

4.根據權利要求1所述的一種2-酮基-L-古龍酸中蛋白質含量的分析方法，其特征在于KOH稀堿溶液的配制原則在于配制后的溶液是均勻混合物，常溫下長時間存放無溶質析出。

5.根據權利要求1所述的一種檢測2-酮基-L-古龍酸中蛋白質含量的方法，其特征在于步驟(5)供試品溶液配置中，pH調節范圍優化為3.5～7，0＜RSD＜3％。?

6.根據權利要求1所述的一種檢測2-酮基-L-古龍酸中蛋白質含量的方法，其特征在于步驟(6)中所述的595nm處吸光度的測量時間優化為加入考馬斯亮藍染色劑后30～60min內完成，0＜RSD＜3％。?