[發(fā)明專利]一種以氯嘧磺隆為底物的混菌降解菌劑的篩選方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910010877.8
• 申請(qǐng)日: 2009-03-25
• 公開（公告）號(hào): CN101845393A
• 公開（公告）日: 2010-09-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張惠文;張曉黎;蔡穎慧;李旭;李新宇;蘇振成
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所
• 主分類號(hào): C12N1/00
• 分類號(hào): C12N1/00;C12Q1/04;A62D3/02;A62D101/28;A62D101/04;C12R1/00
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標(biāo)代理有限公司 21002
• 代理人: 許宗富;周秀梅

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物降解農(nóng)藥殘留技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是一種以氯嘧磺隆為底物的混菌降解菌劑的篩選方法。

技術(shù)背景

氯嘧磺隆是廣譜廣效的大豆田除草劑，90年代初就開始在我國使用，每公頃用有效量僅為15-22.5克，使用方便，成本低，應(yīng)用面積非常廣泛，我國每年大豆種植面積約900萬公頃，氯嘧磺隆的使用面積就達(dá)250多萬公頃，接近1/3。僅黑龍江省，每年大豆田氯嘧磺隆使用量就超過400噸，覆蓋133萬公頃。但是由于氯嘧磺隆不易揮發(fā)，不易光解，殘留期很長，所以易對(duì)后茬敏感作物造成藥害，這樣就嚴(yán)重影響了作物的輪作，換茬及種植結(jié)構(gòu)的調(diào)整，使農(nóng)民只能被動(dòng)的連作，造成病蟲害難以控制的惡性循環(huán)。同時(shí)，氯嘧磺隆對(duì)土壤功能微生物，例如熒光假單胞菌和硝化細(xì)菌有一定的影響，也會(huì)導(dǎo)致土壤功能的改變甚至衰退。所以，如何消除氯嘧磺隆的殘留毒害問題一直視專家們關(guān)注的熱點(diǎn)。

目前，國內(nèi)外很多專家采取了一系列措施來減少氯嘧磺隆殘留所造成的危害，主要有添加復(fù)配劑降低氯嘧磺隆的用量，開發(fā)抗藥性轉(zhuǎn)基因作物，開發(fā)化學(xué)解毒劑等，但這些措施并不能從根本上解決農(nóng)藥殘留問題。國內(nèi)外開發(fā)微生物菌劑來消除農(nóng)藥殘留污染的先例已經(jīng)很多，而且有很多成功的案例，比如有機(jī)磷類農(nóng)藥，擬除蟲菊酯類農(nóng)藥，氨基甲酸酯類農(nóng)藥等，但是分離出的單菌菌劑活性較低，在環(huán)境中退化和遭排斥的可能性很大，活性不穩(wěn)定，限制了應(yīng)用。磺酰脲類除草劑比較難降解，目前這方面的菌劑很少，但是研究發(fā)現(xiàn)，微生物降解也是該類農(nóng)藥的一個(gè)主要的降解途徑，由于結(jié)構(gòu)復(fù)雜，難降解，所以考慮混菌菌劑應(yīng)該是生物降解農(nóng)藥的可行方向。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種快速、高效的以氯嘧磺隆為底物的混菌降解菌劑的篩選方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

以氯嘧磺隆為底物的混菌降解菌劑的篩選方法：取土壤菌懸液，其為田間多年受氯嘧磺隆污染的土樣為處理對(duì)象，制成土壤菌懸液，在1/5LB培養(yǎng)基中添加氯嘧磺隆濃度為100mg/L，按照體積百分比5-10％的接種量接種菌懸液，28-30℃，150-180r/min搖床培養(yǎng)5-7天，按體積百分比5-10％的接種量將培養(yǎng)液接種于新的1/5LB培養(yǎng)基，氯嘧磺隆的濃度按100mg/L遞增，依次類推，5次轉(zhuǎn)接后，培養(yǎng)基中氯嘧磺隆濃度為500mg/L，再按體積比5-10％的接種量轉(zhuǎn)接5次，氯嘧磺隆的添加濃度始終為500mg/L，得到富集的混菌菌種，液相色譜法測(cè)得該混菌菌種對(duì)培養(yǎng)基中氯嘧磺隆的降解率達(dá)到70％以上，將上述菌種發(fā)酵擴(kuò)大培養(yǎng)經(jīng)處理后，即得到以氯嘧磺隆為底物的混菌降解菌劑。

所述的1/5LB培養(yǎng)基的配方為：胰蛋白胨2g，酵母粉1g，氯化鈉2g，蒸餾水1000ml?pH＝7.0。

液相色譜法測(cè)降解率的條件為，C₁₈反相柱(4.6um×250mm)，DAD二級(jí)管陣列檢測(cè)器，流動(dòng)相為甲醇、水和冰醋酸，其體積比為：70∶30∶0.1；流速為1ml/min；檢測(cè)波長為254nm；柱溫為28-30℃；進(jìn)樣量為5-10μl。

所述發(fā)酵培養(yǎng)為，富集得到的混菌菌種，在1/5LB培養(yǎng)基中，進(jìn)行發(fā)酵擴(kuò)大培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后菌體數(shù)量達(dá)到10億個(gè)/mL以上，用麥麩和泥炭在40-50℃下吸附風(fēng)干粉碎，即得到以氯嘧磺隆為底物的混菌降解菌劑。擴(kuò)大培養(yǎng)，發(fā)酵罐的條件為：無菌空氣的通氣量為1∶0.8-1，攪拌速度為180-200r/min，培養(yǎng)溫度為28-30℃，培養(yǎng)時(shí)間為48-60h。二級(jí)發(fā)酵結(jié)束后菌體數(shù)量達(dá)到10億個(gè)/ml以上，用質(zhì)量比2∶8-1∶9的麥麩和泥炭吸附，在40-50℃下風(fēng)干粉碎。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

1.富集得出高效混菌菌劑，降解農(nóng)藥殘留，活性更高更穩(wěn)定，成本降低。

2.取田間污染土樣作為處理對(duì)象，菌種取之土，用之土，增強(qiáng)適應(yīng)能力。

3.利用微生物降解農(nóng)藥殘留，綠色環(huán)保，不僅保護(hù)后茬作物，更重要的是對(duì)調(diào)整種植結(jié)構(gòu)，提高作物的病蟲害抵抗能力。

4.本發(fā)明采用對(duì)氯嘧磺隆敏感的玉米作為指示作物，盆栽實(shí)驗(yàn)，能夠直觀地驗(yàn)證本發(fā)明的菌劑對(duì)土壤中氯嘧磺隆的降解效果。

具體的實(shí)施方式

實(shí)施例1