[發明專利]一種以氯嘧磺隆為底物的混菌降解菌劑的篩選方法

無效

• 申請號: 200910010877.8
• 申請日: 2009-03-25
• 公開（公告）號: CN101845393A
• 公開（公告）日: 2010-09-29
• 發明（設計）人: 張惠文;張曉黎;蔡穎慧;李旭;李新宇;蘇振成
• 申請（專利權）人: 中國科學院沈陽應用生態研究所
• 主分類號: C12N1/00
• 分類號: C12N1/00;C12Q1/04;A62D3/02;A62D101/28;A62D101/04;C12R1/00
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 許宗富;周秀梅

技術領域

本發明涉及生物降解農藥殘留技術領域，具體的說是一種以氯嘧磺隆為底物的混菌降解菌劑的篩選方法。

技術背景

氯嘧磺隆是廣譜廣效的大豆田除草劑，90年代初就開始在我國使用，每公頃用有效量僅為15-22.5克，使用方便，成本低，應用面積非常廣泛，我國每年大豆種植面積約900萬公頃，氯嘧磺隆的使用面積就達250多萬公頃，接近1/3。僅黑龍江省，每年大豆田氯嘧磺隆使用量就超過400噸，覆蓋133萬公頃。但是由于氯嘧磺隆不易揮發，不易光解，殘留期很長，所以易對后茬敏感作物造成藥害，這樣就嚴重影響了作物的輪作，換茬及種植結構的調整，使農民只能被動的連作，造成病蟲害難以控制的惡性循環。同時，氯嘧磺隆對土壤功能微生物，例如熒光假單胞菌和硝化細菌有一定的影響，也會導致土壤功能的改變甚至衰退。所以，如何消除氯嘧磺隆的殘留毒害問題一直視專家們關注的熱點。

目前，國內外很多專家采取了一系列措施來減少氯嘧磺隆殘留所造成的危害，主要有添加復配劑降低氯嘧磺隆的用量，開發抗藥性轉基因作物，開發化學解毒劑等，但這些措施并不能從根本上解決農藥殘留問題。國內外開發微生物菌劑來消除農藥殘留污染的先例已經很多，而且有很多成功的案例，比如有機磷類農藥，擬除蟲菊酯類農藥，氨基甲酸酯類農藥等，但是分離出的單菌菌劑活性較低，在環境中退化和遭排斥的可能性很大，活性不穩定，限制了應用。磺酰脲類除草劑比較難降解，目前這方面的菌劑很少，但是研究發現，微生物降解也是該類農藥的一個主要的降解途徑，由于結構復雜，難降解，所以考慮混菌菌劑應該是生物降解農藥的可行方向。

發明內容

本發明的目的是提供一種快速、高效的以氯嘧磺隆為底物的混菌降解菌劑的篩選方法。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：

以氯嘧磺隆為底物的混菌降解菌劑的篩選方法：取土壤菌懸液，其為田間多年受氯嘧磺隆污染的土樣為處理對象，制成土壤菌懸液，在1/5LB培養基中添加氯嘧磺隆濃度為100mg/L，按照體積百分比5-10％的接種量接種菌懸液，28-30℃，150-180r/min搖床培養5-7天，按體積百分比5-10％的接種量將培養液接種于新的1/5LB培養基，氯嘧磺隆的濃度按100mg/L遞增，依次類推，5次轉接后，培養基中氯嘧磺隆濃度為500mg/L，再按體積比5-10％的接種量轉接5次，氯嘧磺隆的添加濃度始終為500mg/L，得到富集的混菌菌種，液相色譜法測得該混菌菌種對培養基中氯嘧磺隆的降解率達到70％以上，將上述菌種發酵擴大培養經處理后，即得到以氯嘧磺隆為底物的混菌降解菌劑。

所述的1/5LB培養基的配方為：胰蛋白胨2g，酵母粉1g，氯化鈉2g，蒸餾水1000ml?pH＝7.0。

液相色譜法測降解率的條件為，C₁₈反相柱(4.6um×250mm)，DAD二級管陣列檢測器，流動相為甲醇、水和冰醋酸，其體積比為：70∶30∶0.1；流速為1ml/min；檢測波長為254nm；柱溫為28-30℃；進樣量為5-10μl。

所述發酵培養為，富集得到的混菌菌種，在1/5LB培養基中，進行發酵擴大培養，發酵結束后菌體數量達到10億個/mL以上，用麥麩和泥炭在40-50℃下吸附風干粉碎，即得到以氯嘧磺隆為底物的混菌降解菌劑。擴大培養，發酵罐的條件為：無菌空氣的通氣量為1∶0.8-1，攪拌速度為180-200r/min，培養溫度為28-30℃，培養時間為48-60h。二級發酵結束后菌體數量達到10億個/ml以上，用質量比2∶8-1∶9的麥麩和泥炭吸附，在40-50℃下風干粉碎。

本發明的優點在于：

1.富集得出高效混菌菌劑，降解農藥殘留，活性更高更穩定，成本降低。

2.取田間污染土樣作為處理對象，菌種取之土，用之土，增強適應能力。

3.利用微生物降解農藥殘留，綠色環保，不僅保護后茬作物，更重要的是對調整種植結構，提高作物的病蟲害抵抗能力。

4.本發明采用對氯嘧磺隆敏感的玉米作為指示作物，盆栽實驗，能夠直觀地驗證本發明的菌劑對土壤中氯嘧磺隆的降解效果。

具體的實施方式

實施例1