[發(fā)明專(zhuān)利]一種海洋鹵代酸脫鹵微生物的分離篩選方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910010867.4
• 申請(qǐng)日: 2009-03-25
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101845405A
• 公開(kāi)（公告）日: 2010-09-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張衛(wèi);黃劍宇;信艷娟
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12N1/20
• 分類(lèi)號(hào): C12N1/20;C12Q1/04;C12R1/385;C12R1/40
• 代理公司: 沈陽(yáng)科苑專(zhuān)利商標(biāo)代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳;周秀梅

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及海洋鹵代酸脫鹵微生物，具體地說(shuō)是海洋中有氧條件下催化鹵代酸脫鹵微生物的分離篩選的新方法。

背景技術(shù)

鹵化物被廣泛地用來(lái)生產(chǎn)殺蟲(chóng)劑，除草劑，工業(yè)用溶劑和脫脂劑，其中鹵代酸尤其手性純產(chǎn)品有著巨大的應(yīng)用前景。同時(shí)由于大量使用，現(xiàn)在有機(jī)鹵化物已成為公認(rèn)的“危險(xiǎn)性”有毒污染物，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)鹵代酸廣泛存在于自然環(huán)境之中，尤其是水環(huán)境中。研究脫鹵酸脫鹵酶一方面可以生產(chǎn)手性有機(jī)中間體，另一方面有重大環(huán)境應(yīng)用價(jià)值可以用于污染水源的脫鹵處理，工廠的有機(jī)廢水處理，用于環(huán)境修復(fù)等方面。傳統(tǒng)的鹵代酸分離純化方法都是以土壤為分離源，通過(guò)檢測(cè)微生物脫鹵產(chǎn)生的鹵族元素來(lái)篩選。由于海洋中很多微生物，海洋藻類(lèi)，海洋動(dòng)物可產(chǎn)生多種鹵化物，同時(shí)由于大量的工業(yè)和生活廢水排放入海，使得海洋中有機(jī)鹵化物的含量和種類(lèi)都非常豐富。海洋相對(duì)于陸地是脫鹵微生物的更好分離源。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種簡(jiǎn)便易行、快速有效的海洋鹵代酸脫鹵微生物的分離篩選新方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

首先選取海洋中鹵化物較豐富的海區(qū)(如污染嚴(yán)重的河口區(qū))或經(jīng)檢驗(yàn)含有豐富鹵化物的海區(qū)中微生物多樣性高的海洋樣品為分離源；通過(guò)特殊設(shè)計(jì)的鹵代酸單一碳源液體培養(yǎng)富集培養(yǎng)樣品中的脫鹵微生物，通過(guò)檢測(cè)培養(yǎng)基顏色變化，快速獲得大量目的微生物；以顯色平板對(duì)富集后的大量微生物進(jìn)行篩選，通過(guò)顏色變化很容易挑出活性較好的目的菌株；最后對(duì)初篩得到的目的菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)，用HPLC的方法對(duì)菌株脫鹵能力進(jìn)行檢測(cè)，以比色法檢測(cè)菌液OD600值來(lái)比較菌株生長(zhǎng)能力，最終得到生長(zhǎng)性狀良好降解能力較強(qiáng)的脫鹵菌株。目標(biāo)菌株可以在有氧條件下催化鹵代物進(jìn)行脫鹵反應(yīng)，其反應(yīng)式為：

RCLOOH+H₂O→ROHCOOH+HCL

一種海洋鹵代酸脫鹵微生物的分離篩選方法，以海洋樣品為菌株分離源，以鹵代酸為單一碳源進(jìn)行富集培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)顯色平板和液體培養(yǎng)篩選得到具有鹵代酸脫鹵能力的菌株，具體工藝步驟如下：

1)取海洋樣品，稱(chēng)重，樣品于裝有無(wú)菌海水的燒杯中洗滌3～5次，洗去樣品表面附著的微生物和其它雜質(zhì)；

2)將樣品放入滅菌后的研缽中，加入其5-10倍重量體積比(5-10mL無(wú)菌海水/g樣品)的無(wú)菌海水，研磨至均勻的漿液；取漿液1-10mL加入100mL鹵代酸液體培養(yǎng)基中，在三角燒瓶中20～40℃，150～250轉(zhuǎn)/分搖瓶培養(yǎng)；觀察培養(yǎng)液顏色變化由藍(lán)色變?yōu)槌燃t色時(shí)，取1-10mL菌液加入新的鹵代酸液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)搖瓶培養(yǎng)；

3)觀察菌液再次變?yōu)槌燃t色時(shí)取0.5mL，加入裝有4.5mL無(wú)菌海水的試管中渦旋混勻，取混勻后的菌液200ul備用；

再取上述混勻后的菌液0.5mL，加入裝有4.5mL無(wú)菌海水的試管中渦旋混勻，取混勻后的菌液200ul備用；

重復(fù)上述操作過(guò)程6-9次，使最終菌液的濃度稀釋到原培養(yǎng)后濃度的10^-6～10^-9；

4)分別取上述稀釋操作中各步的備用菌液50-200ul涂鹵代酸顯色培養(yǎng)基平板，每個(gè)備用菌液涂5～10個(gè)平板；25～35℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，觀察菌株生長(zhǎng)與情況，當(dāng)平板上出現(xiàn)明顯的橙紅色菌株后挑取深紅色的菌落在鹵代酸顯色平板上劃線；劃線后的平板再于25～35℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3～5天，挑取深紅色的單菌落繼續(xù)在顯色平板上劃線培養(yǎng)，重復(fù)這一過(guò)程3～5次；

5)挑選深紅色的菌落接種2216E平板，培養(yǎng)2～3天后挑取單菌落接種2216E液體培養(yǎng)基在試管中25～35℃，150～250轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)24～48小時(shí)，觀察培養(yǎng)液出現(xiàn)明顯渾濁后取菌液加入裝有體積濃度15-20％甘油水溶液的凍存管中顛倒混勻后-70℃放置保存?zhèn)溆茫?/p>

6)在菌株生長(zhǎng)的2216E平板上，取1環(huán)菌體接種到裝有100～200mL鹵代酸液體培養(yǎng)基的三角燒瓶中，培養(yǎng)基中鹵代酸濃度10～30mM，25～35℃，150～250轉(zhuǎn)/分搖瓶培養(yǎng)；3天后分光光度計(jì)檢測(cè)菌液在600nM波長(zhǎng)檢測(cè)光下吸光值(OD600)，HPLC檢測(cè)菌液中殘留鹵代酸量，OD600值大于等于1，鹵代酸降解率(殘留鹵代酸濃度/鹵代酸初始濃度)大于等于50％的菌株即為高活力鹵代酸脫鹵菌株。

所述海洋樣品為海洋生物、海洋植物、海底沉積物、海泥或海水中的未濾過(guò)物，海水中的未濾過(guò)物是指將海水樣品用0.22uM膜抽濾，膜表面殘留的未濾過(guò)物。