[發(fā)明專利]一種海洋鹵代酸脫鹵微生物的分離篩選方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910010867.4
• 申請日: 2009-03-25
• 公開（公告）號: CN101845405A
• 公開（公告）日: 2010-09-29
• 發(fā)明（設計）人: 張衛(wèi);黃劍宇;信艷娟
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12Q1/04;C12R1/385;C12R1/40
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳;周秀梅

1.一種海洋鹵代酸脫鹵微生物的分離篩選方法，其特征在于：以海洋樣品為菌株分離源，以鹵代酸為單一碳源進行富集培養(yǎng)，經(jīng)過顯色平板和液體培養(yǎng)篩選得到具有鹵代酸脫鹵能力的菌株，具體工藝步驟如下：

1)取海洋樣品，稱重，樣品于裝有無菌海水的燒杯中洗滌3～5次，洗去樣品表面附著的微生物和其它雜質；

2)將樣品放入滅菌后的研缽中，加入無菌海水，無菌海水的加入量為5-10mL無菌海水/g樣品，研磨至均勻的漿液；取漿液1-10mL加入100mL鹵代酸液體培養(yǎng)基中，在三角燒瓶中20～40℃，150～250轉/分搖瓶培養(yǎng)；觀察培養(yǎng)液顏色變化由藍色變?yōu)槌燃t色時，取1-10mL搖瓶中的培養(yǎng)液加入至100mL新的鹵代酸液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)搖瓶培養(yǎng)；

3)觀察菌液再次變?yōu)槌燃t色時取培養(yǎng)液0.5mL，加入裝有4.5mL無菌海水的試管中渦旋混勻，取混勻后的菌液200ul備用；

再取上述混勻后的菌液0.5mL，加入裝有4.5mL無菌海水的試管中渦旋混勻，取混勻后的菌液200ul備用；

重復上述操作過程6-9次，使最終菌液的濃度稀釋到原培養(yǎng)后濃度的10^-6-10^-9；

4)分別取上述稀釋操作中各步的備用菌液50-200ul涂鹵代酸顯色培養(yǎng)基平板，每個備用菌液涂5～10個平板；25～35℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，觀察菌株生長與情況，當平板上出現(xiàn)明顯的橙紅色菌株后挑取深紅色的菌落在鹵代酸顯色平板上劃線；劃線后的平板再于25～35℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3～5天，挑取深紅色的單菌落繼續(xù)在顯色平板上劃線培養(yǎng)，重復這一過程3～5次；

5)挑選深紅色的菌落接種2216E平板，培養(yǎng)2～3天后挑取單菌落接種2216E液體培養(yǎng)基在試管中25～35℃，150～250轉/分培養(yǎng)24～48小時，觀察培養(yǎng)液出現(xiàn)明顯渾濁后取菌液加入裝有體積濃度15-20％甘油水溶液的凍存管中顛倒混勻后-70℃放置保存?zhèn)溆茫?/p>

6)在菌株生長的2216E平板上，取1環(huán)菌體接種到裝有100～200mL鹵代酸液體培養(yǎng)基的三角燒瓶中，培養(yǎng)基中鹵代酸濃度10～30mM，25～35℃，150～250轉/分搖瓶培養(yǎng)；3天后分光光度計檢測菌液在600nM波長檢測光下吸光值，HPLC檢測菌液中殘留鹵代酸量，OD600值≥1，鹵代酸降解率≥50％的菌株即為高活力鹵代酸脫鹵菌株。

2.根據(jù)權利要求1所述的分離篩選方法，其特征在于：所述海洋樣品為海洋生物、海洋植物、海底沉積物、海泥或海水中的未濾過物，海水中的未濾過物是指將海水樣品用0.22uM膜抽濾，膜表面殘留的未濾過物。

3.根據(jù)權利要求1所述的分離篩選方法，其特征在于：所述的鹵代酸液體培養(yǎng)基配制過程如下：

將KH₂PO₄1～2g、Na₂HPO₄12H₂O?10～12g、溴百里酚蘭40～80mg、(NH₄)₂SO₄1～2g和酵母浸粉0.01～0.05g加入到1L陳海水中，調pH值到7.5～9.0，120-125度蒸汽滅菌15～20分鐘后，放置冷卻到50～80℃，加入濃度為1M?pH為7.0經(jīng)0.22uM濾膜過濾除菌的鹵代酸，至鹵代酸的終濃度為10～30mM。

4.根據(jù)權利要求3所述的分離篩選方法，其特征在于：所述鹵代酸是指烴鏈2號位為鹵族元素氯、溴、氟或碘取代的鹵代脂肪酸。

5.根據(jù)權利要求4所述的分離篩選方法，其特征在于：所述鹵代脂肪酸為2-氯丙酸或2-2氯丙酸。

6.根據(jù)權利要求1所述的分離篩選方法，其特征在于：所述鹵代酸顯色培養(yǎng)基配制過程如下，將(NH₄)₂SO₄2g、酵母浸粉0.05g、瓊脂15～20g、溴百里酚蘭40～80mg加入到1L陳海水中，調pH值到7.5～9.0，120-125度蒸汽滅菌15-20分鐘后，放置冷卻到50～80℃，加入濃度為1M?pH為7.0經(jīng)0.22uM濾膜過濾除菌的鹵代酸，至鹵代酸的終濃度為10～30mM。