[發明專利]食品中三種產芽孢菌的檢測試劑盒及其檢測方法

無效

• 申請號: 200910010800.0
• 申請日: 2009-03-20
• 公開（公告）號: CN101591704A
• 公開（公告）日: 2009-12-02
• 發明（設計）人: 鄭秋月
• 申請（專利權）人: 鄭秋月
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N30/02;C12R1/085;C12R1/145
• 代理公司: 大連東方專利代理有限責任公司
• 代理人: 劉曉琴

技術領域

本發明涉及食品中三種產芽孢菌的檢測試劑盒及其檢測方法。尤其涉及用于PCR-DHPLC快速高通量檢測的試劑盒及其相應的檢測方法。?

背景技術

一直認為食品加工過程中熱處理會破壞所有微生物群落，但實際研究發現，超高溫處理食品中仍會有耐熱性菌以及芽胞殘留；尤其巴氏加熱法處理的食品，只能殺死其中大部分細菌，仍存在大部分嗜熱菌及耐熱性菌以及芽胞等。同時，即使超高溫處理，芽胞菌產生的毒素也不會被滅活，殘存的芽胞菌及毒素是熱加工食品中潛在的生物危險因子。適宜條件下，殘存細菌重新繁殖并產生毒素。熱加工處理食品中殘存的未知芽胞桿菌污染及其產生毒素導致的食源性疾病經常發生，是潛在食品衛生和安全隱患。至少包括蠟樣芽胞桿菌、肉毒梭狀芽胞桿菌等多種芽胞桿菌可能在熱加工處理食品中存在。產毒素芽胞菌如蠟樣芽胞桿菌產生的腸毒素，肉毒梭狀芽胞桿菌產生的肉毒毒素等在超高溫處理過程下，仍保持活性。熱加工處理食品中產孢子菌及其毒素對食品衛生和安全的影響應該引起重視。?

肉毒梭菌所致食物中毒，是肉毒梭菌在食品中于厭氧狀態下繁殖產生外毒素而引起的一種典型的毒素型中毒。此毒素毒性極強，人的最小致死量為0.1μg。最早報告本菌引起的食物中毒，是1895年在比利時因吃腌制火腿所引起的20多人中毒的事件，在火腿瘦肉和死者內臟中都檢出肉毒梭菌。引起中毒的食品有臘腸、火腿、魚及魚制品和罐頭食品等。在美國以家制罐頭發生中毒的較多，日本以魚制品較多。在我國主要與堆放牛羊肉和發酵食品等有關，由香腸引起的肉毒中毒事件也有報告。?

蠟樣芽胞桿菌食物中毒所涉及的食品種類繁多，包括奶類食品、禽畜肉類制品、蔬菜、湯汁、豆芽和米飯等。在我國引起中毒的食品大多與米飯或淀粉類制品有關，歐美國家多由甜點心、肉餅、色拉和奶、肉類食品引起。蠟樣芽胞桿菌食物中毒是由于該菌產生腸毒素所致。大量活菌的存在，不僅可使腸毒?素量增高，且可促進中毒發生。近年來，英國發生5起蠟樣芽胞桿菌嚴重食物中毒事件。在我國部分地區，蠟樣芽胞桿菌食物中毒占細菌性食物中毒的首位。?

由于產芽孢桿菌類培養條件較為特殊，國內外缺少檢測、鑒定和定量產孢子菌類的快速和易用的檢測技術和檢測試劑盒。歐盟食品安全規范中除了蠟樣芽孢桿菌和亞硫酸鹽還原梭狀芽孢桿菌及嗜溫芽胞桿菌外，沒有產芽孢桿菌類的檢測標準方法。?

在我國，對產芽孢桿菌檢測還多停留在檢測效率低、目標單一的水平上，還主要依靠傳統的增菌、分離、生化鑒定方法，一般說來鑒定一種產芽孢細菌需要10～20天，這就影響了檢測鑒定的周期，該現狀顯然不能滿足目前食品安全迅速發展的需求。即便現在已經發展起來了PCR和實時PCR技術，但也僅可達到對已知的常規致病菌進行檢測。而對于混合微生物樣本、不常見的、苛刻的、發生變異的芽孢細菌則缺乏穩定而可靠的鑒定手段。因此，急需建立高效、快捷、簡便的檢測方法。?

發明內容

本發明的目的在于提供一種用于靈敏快速檢測食品中三種產芽孢菌，包括蠟樣芽胞桿菌、肉毒梭狀芽胞桿菌、產氣莢膜梭菌的mPCR-DHPLC檢測試劑盒。?

本發明所述的試劑盒包括濃度為5U/μL的Taq?DNA聚合酶和PCR反應液；其中的PCR反應液中含10mM?Tris·HCl、50mM?KCl、25mM?MgCl₂、dNTP(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)各2.5mM及3種產芽孢菌的引物對各10μM，所述的引物對序列如下：?

其中，N₁是A、T或C；N₂是A或G；N₃是C或T；N₄是A或T；N₅是A或T；N₆是G或A；N₇是C或T；N₈是C或T；N₉是C或T；?

試劑盒保存條件：-20℃保存。?

本發明還提供了利用上述試劑盒檢測上述這3種產芽孢菌的方法，包括如下步驟：?

①取2ul待測樣品DNA溶液，加入10ul試劑盒中的PCR反應液、0.2μLTaq?DNA聚合酶及滅菌超純水12.8μL，總體積25μL；5000r/min離心10s，然后按下列參數進行PCR擴增：?

預變性：94℃，3min；?

進入循環：94℃變性60s，60℃退火60s，72℃延伸60s，35個循環；?

終止延伸：72℃，7min；?

PCR產物4℃保存；?