[發(fā)明專利]食品中三種產(chǎn)芽孢菌的檢測試劑盒及其檢測方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910010800.0
• 申請日: 2009-03-20
• 公開（公告）號: CN101591704A
• 公開（公告）日: 2009-12-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄭秋月
• 申請（專利權(quán)）人: 鄭秋月
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N30/02;C12R1/085;C12R1/145
• 代理公司: 大連東方專利代理有限責(zé)任公司
• 代理人: 劉曉琴

1.食品中三種產(chǎn)芽孢菌的檢測試劑盒，其特征在于包括濃度為5U/μL的 Taq?DNA聚合酶和PCR反應(yīng)液；其中的PCR反應(yīng)液中含10mM?Tris·HCl、50mM KCl、25mM?MgCl₂、dNTP各2.5mM及3種產(chǎn)芽孢菌的引物對各10μM，所述 的引物對序列如下：

其中，N₁是A、T或C；N₂是A或G；N₃是C或T；N₄是A或T；N₅是 A或T；N₆是G或A；N₇是C或T；N₈是C或T；N₉是C或T；

試劑盒保存條件：-20℃保存。

2.食品中三種產(chǎn)芽孢菌的檢測方法，其特征在于使用權(quán)利要求1所述的試 劑盒，包括如下步驟：

①取2ul待測樣品DNA溶液，加入10ul試劑盒中的PCR反應(yīng)液、0.2μL Taq?DNA聚合酶及滅菌超純水12.8μL，總體積25μL；5000r/min離心10s，然 后按下列參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增：

預(yù)變性：94℃，3min；

進(jìn)入循環(huán)：94℃變性60s，60℃退火60s，72℃延伸60s，35個(gè)循環(huán)；

終止延伸：72℃，7min；

PCR產(chǎn)物4℃保存；

②將PCR產(chǎn)物進(jìn)行DHPLC分析，DHPLC分析條件如下：

檢測器：熒光檢測器，光源：150W?Xenon燈；激發(fā)譜帶寬：15nm；發(fā)射 譜帶寬：15.3nm；檢測靈敏度：在波長350nm積分2s；

色譜柱：PS-DVB&C18?DNASep色譜柱，4.6mm×50mm，粒度3μm；

柱溫：50℃；

流動(dòng)相(體積比)：0.0min，55.0％緩沖溶液A，45.0％緩沖溶液B，

3.5min，50.2％緩沖溶液A，49.8％緩沖溶液B，

6.2min，41.8％緩沖溶液A，58.2％緩沖溶液B，

8.4min，38.2％緩沖溶液A，61.8％緩沖溶液B，

10.4min，36.3％緩沖溶液A，63.7％緩沖溶液B，

12.4min，35.0％緩沖溶液A，65.0％緩沖溶液B，

其中，緩沖溶液A為50ml?TEAA和250μl乙腈混合，加滅菌超純水定容至 1000ml所得溶液；緩沖溶液B為50ml?TEAA和250ml乙腈混合，加滅菌超純水 定容至1000ml所得溶液；

流速：0.9mL/min；

上樣量：PCR產(chǎn)物5μL。