[發明專利]致瀉性大腸埃希氏菌檢測試劑盒及其檢測方法

無效

• 申請號: 200910010793.4
• 申請日: 2009-03-20
• 公開（公告）號: CN101665823A
• 公開（公告）日: 2010-03-10
• 發明（設計）人: 徐君怡
• 申請（專利權）人: 徐君怡
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N30/02;C12R1/185
• 代理公司: 大連東方專利代理有限責任公司
• 代理人: 劉曉琴

技術領域

本發明涉及病原微生物的檢測試劑盒及檢測方法，尤其涉及食品中致瀉性大腸埃希氏菌mPCR-DHPLC檢出試劑盒及方法。

背景技術

致瀉性大腸埃希氏菌是與人類疾病有關的大腸桿菌的統稱，包括腸產毒性大腸桿菌(Enterotoxigenic?E.coli，ETEC)、腸致病性大腸桿菌(EnteropathogenicE.coli，EPEC)、腸出血性大腸桿菌(Enterohemorrhagic?E.coli，EHEC)、腸侵襲性大腸桿菌(Enteroinvasive?E.coli，EIEC)等。致瀉性大腸桿菌是引起人體以腹瀉癥狀為主的全球性疾病的主要致病菌，其中尤以EPEC、ETEC所占比例為大。多年來，致瀉性大腸桿菌引起的腹瀉病例始終位于第二位，可見大腸桿菌腸道傳染的廣泛性。EHEC?O157：H7已被世界衛生組織(WHO)定為新的食源性致病菌，其引發的出血性腸炎的暴發或散發病例，自1983年以來在北美州(美國、加拿大)地區逐年增多，英國、日本亦有爆發和散發病例報道，我國也發現散發病例，尚未有爆發EHEC的報道。

目前，我國對大腸桿菌的診斷和流行病學調查也主要仍依靠菌株血清型的菌體抗原進行鑒定，但血清學分型檢測有其弊端：檢測周期長并易受人為因素干擾，在一些不同的“O”血清型之間存在著交叉反應，而且多數從腹瀉病人糞便標本中分離出的大腸桿菌并不能用現有的血清抗原進行診斷鑒定。因而在許多臨床實驗室中，仍將未能鑒定的大腸桿菌作為腸道正常菌群看待，僅根據少數生化指標，甚至僅根據乳糖發酵一項就將分離物作為“雜菌”丟棄，從而殆誤診斷和治療的例子屢見不鮮?，F在國內關于致病性大腸桿菌的國家標準(GB/T4789.6-2003)和行業標準檢測方法還是傳統的微生物學檢測方法，尚不夠完善，四種致瀉性大腸桿菌的分類鑒定僅依靠血清學凝集反應現象，而很多情況下腸致病性大腸桿菌和腸出血性大腸桿菌容易出現血清學的交叉反應，很難進行區分。而國外的傳統微生物檢測方法(如FDA、AOAC、ISO等)也是以單一的或少數目標菌為目的設計的程序，既費時又費力。目前，有些成熟的微生物快速鑒定系統已經被應用于致瀉性大腸桿菌的檢測，但是開發較多的也僅限于腸出血性大腸桿菌O157:H7。如熒光免疫檢測法(VIDAS)、BAX全自動病原菌篩選系統、API20E等。在分子生物學檢測方面，目前FDA2004標準仍是以檢測一種致瀉性大腸桿菌為目的設計程序，檢測不同的致瀉性大腸桿菌需要不同的反應條件。因此，建立高效、快捷、高通量的致瀉性大腸埃希氏菌分型鑒定技術是食品安全所面臨的急需解決的問題。

變性高效液相色譜(DHPLC)采用離子對反相高效液相色譜的原理，是通過使用特殊的耐高溫液相色譜分離柱同時采用溫度調控的方式，對核苷酸片段分子進行分析分離的方法，因此，也有人稱該技術為溫度調控離子對反相高效液相色譜。該技術的發明為生命科學領域里的核酸分析提供了方便實用的技術平臺。其快速高通量、全自動化操作、準確度高、重復性好及敏感性高的優點使其在核酸分析中具有無可替代的優勢。DHPLC技術檢測微生物是很好的培養不依賴的混合微生物樣本的分析平臺，不僅能鑒定常見的微生物，還能鑒定不常見的，苛刻的，和厭氧的細菌。該技術在已知和未知基因突變的檢測和篩選、基因分型、基因定量和長度多態性分析等領域已經得到廣泛應用。

基于此，本發明人試圖建立利用DHPLC的高效、快捷、簡便的適宜臨床檢測應用的特異而靈敏的致瀉性大腸埃希氏菌的檢測方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種用于靈敏快捷地檢測樣品、尤其是檢測食品中致瀉性大腸埃希氏菌以判定待檢樣品是否受到污染的試劑盒及其檢測方法。

首先，本發明所述的致瀉性大腸埃希氏菌檢測試劑盒是：

1mL檢測溶液含10mM?Tris·Cl、50mM?KCl、25mM?MgCl2、dNTP(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)各2.5mM、Taq?DNA聚合酶5000U(即5U/μL)及四種致瀉性大腸埃希氏菌引物對各10μM；

其中，針對四種致瀉性大腸埃希氏菌的目的基因及特異性引物序列如下：

本發明還提供了利用上述試劑盒檢測致瀉性大腸埃希氏菌的檢測方法，包括如下步驟：

①取1ul待測樣品DNA溶液，加入10ul試劑盒溶液和14ul滅菌超純水，總體積25ul；5000r/min離心10s，然后按下列參數進行PCR擴增：

預變性：94℃，3min；

進入循環：94℃變性60s，56℃退火60s，72℃延伸60s，35次循環；