[發(fā)明專利]致瀉性大腸埃希氏菌檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910010793.4
• 申請(qǐng)日: 2009-03-20
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101665823A
• 公開(kāi)（公告）日: 2010-03-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐君怡
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 徐君怡
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;G01N30/02;C12R1/185
• 代理公司: 大連東方專利代理有限責(zé)任公司
• 代理人: 劉曉琴

1、致瀉性大腸埃希氏菌檢測(cè)試劑盒，其特征在于：

1mL檢測(cè)溶液含10mM?Tris·Cl、50mM?KCl、25mM?MgCl₂、dNTP各2.5mM、Taq?DNA聚合酶5U/μL及四種致瀉性大腸埃希氏菌引物對(duì)各10μM；

其中，致瀉性大腸埃希氏菌的特異性引物序列如下：

2、致瀉性大腸埃希氏菌的檢測(cè)方法，其特征在于使用權(quán)利要求1所述的試劑盒，包括如下步驟：

①取1ul待測(cè)樣品DNA溶液，加入10ul試劑盒溶液和14ul滅菌超純水，總體積25ul；5000r/min離心10s，然后按下列參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增：

預(yù)變性：94℃，3min；

進(jìn)入循環(huán)：94℃變性60s，56℃退火60s，72℃延伸60s，35次循環(huán)；

終止延伸：72℃，7min；

②DHPLC分析：色譜柱：PS-DVB?&?C18DNASep色譜柱(4.6mm×50mm，粒度3μm)；柱溫：50℃；

流動(dòng)相(體積比)：0.0min，55.0％緩沖溶液A，45.0％緩沖溶液B；

????????????????0.5min，50.2％緩沖溶液A，49.8％緩沖溶液B；

????????????????3.6min，41.8％緩沖溶液A，58.2％緩沖溶液B；

????????????????6.8min，38.2％緩沖溶液A，61.8％緩沖溶液B；

????????????????9.9min，36.3％緩沖溶液A，63.7％緩沖溶液B；

????????????????13min，35.0％緩沖溶液A，65.0％緩沖溶液B；

其中，緩沖溶液A是濃度0.1mM的TEAA水溶液；緩沖溶液B是濃度為0.1M?TEAA水溶液與乙腈按體積比3∶1的混合溶液；

流速：0.9mL/min；

檢測(cè)器：熒光檢測(cè)器(光源：150W?Xenon燈；激發(fā)譜帶寬：15nm；發(fā)射譜帶寬：15.3nm；檢測(cè)靈敏度：在波長(zhǎng)350nm積分2s)；

上樣量：PCR產(chǎn)物5μL。