[發明專利]羥喜樹堿的微生物轉化制備方法

無效

• 申請號: 200910010745.5
• 申請日: 2009-03-19
• 公開（公告）號: CN101509023A
• 公開（公告）日: 2009-08-19
• 發明（設計）人: 姜波;王賀雙;高華;張涓涓;畢靜;郝爽
• 申請（專利權）人: 大連理工大學
• 主分類號: C12P17/18
• 分類號: C12P17/18;C12R1/67;C12R1/845
• 代理公司: 大連八方知識產權代理有限公司
• 代理人: 高 杰

技術領域

本發明屬于生物技術領域。具體涉及一種羥喜樹堿的微生物轉化制備方法。

背景技術

自從1966年美國Wall等人首次從中國特有的珙桐科植物喜樹中提取出喜樹堿(Campothecin，CPT)以來，該類生物堿的抗腫瘤作用就一直受到廣泛關注。1985年Hsiang闡述了這類藥物抗腫瘤作用的機制，認為喜樹堿及其衍生物是以DNA拓撲異構酶I為作用靶點，并抑制生物體DNA的合成而發揮抗腫瘤作用的。這使得此類藥物成為除紫杉醇類以外的植物類抗腫瘤藥物研究的第二大熱點。其中羥喜樹堿(Hydroxycamptoyhecin，HCPT)及以羥喜樹堿為中間體合成的拓普替康(Topotecan，TPT)和伊立替康(Camptothecin-II，CPT-II)在臨床上顯示出廣泛的抗腫瘤活性，并且毒副作用相對較小，國內的臨床需求量和出口量逐年增加。為了滿足需求，這類藥物的制備研究也愈來愈多地受到重視，尤其是羥喜樹堿(H???CPT)的制備，因為它不僅本身就是臨床效果較好的抗腫瘤藥物，而且還是制備其它喜樹堿類衍生物的重要中間體。羥喜樹堿是植物喜樹中的一種生物堿，長期以來我國企業一直是從植物中直接提取，但因其含量較低，生產成本較高，難以滿足臨床需要。隨后人們對羥喜樹堿的制備進行了大量研究，包括化學全合成、化學半合成、生物轉化和在近緣植物中尋找新的藥源等，但因種種原因，這些方法仍未用于工業化大生產。

發明內容

本發明人在開展懸浮培養喜樹細胞生產羥喜樹堿的研究中，發現懸浮培養的喜樹細胞經接種某些微生物后，喜樹細胞培養物中羥喜樹堿的含量得到大幅度的提高。因此，針對提高羥喜樹堿得率的微生物培養轉化條件，羥喜樹堿的提取、分離、純化等方面進行了系統的研究，并對其進行了體外抗腫瘤試驗檢測，為建立羥喜樹堿的制備新方法及產業化打下了基礎。

本發明的目在于提供一種羥喜樹堿的制備新方法，利用微生物對懸浮培養的喜樹細胞進行生物轉化從而提高羥喜樹堿得率。

本發明的技術方案是：本發明制備的羥喜樹堿結構式如下：

羥喜樹堿的微生物轉化制備方法，是以喜樹的幼莖為外植體，將在固體培養基上誘導、并繼代的喜樹愈傷組織轉入液體培養基中，進行喜樹細胞懸浮培養，再接種微生物培養轉化；然后經提取、析晶、柱層析、結晶等方法分離純化經微生物轉化后的喜樹細胞培養物中羥喜樹堿，具體如下：

一、喜樹細胞培養系的建立：

A、喜樹愈傷組織的誘導和繼代培養：

喜樹愈傷組織的誘導和繼代培養是在光照培養箱中進行的，光照8-10小時/天，培養溫度為20～35℃，培養3～10天，喜樹愈傷組織每隔3～15天繼代一次，繼代3～10次。

作為誘導、繼代培養喜樹愈傷組織的固體培養基，其基本培養基為MS培養基，其中附加了1.0～1.5mg/l?6-芐基腺嘌呤，2～60g/l蔗糖，1～15g/l尿素，0.6～0.9mg/l?2，4-二氯苯氧乙酸，凝固劑為瓊脂6g/l，pH為5.5～6.5。

B、喜樹細胞培養懸浮系建立：

將A步培養好的喜樹愈傷組織轉入通氣量為0.1～0.51/min的氣升式內環流反應器中培養，溫度為20～35℃，喜樹細胞培養每隔3～15天繼代一次。

進行懸浮培養的液體培養基，其基本培養基為MS培養基，其中附加1.0～1.5mg/l?6-芐基腺嘌呤，2～60g/l蔗糖，1～15g/l尿素，0.6～0.9mg/l?2，4-二氯苯氧乙酸，pH為5.5～6.5。

喜樹細胞培養周期為5～25天。

二、微生物對懸浮培養喜樹細胞的生物轉化：

A.喜樹細胞的懸浮培養及微生物的接種：

無毒黃曲霉Cr-1菌株(Aspergillus.flavus)和根霉T-34菌株(Rhizopus?sp.)的接種：于喜樹細胞培養期的第5～25天接種1％～2％的無毒黃曲霉Cr-1菌株(Aspergillus.flavus)，相距1～100小時后接種1％～2％的根霉T-34菌株(Rhizopus?sp.)；

B.微生物的培養轉化條件：

初始PH值為5.5～6.5，溫度為25～35℃，在接種根霉T-34菌株(Rhizopus?sp.)后再培養轉化1～240小時。

C、喜樹細胞培養物的收獲：

喜樹細胞培養物收獲后，用清水沖洗干凈，減壓抽濾去除殘液后置于恒溫干燥箱中，50～80℃烘干至恒重，磨成粗粉，備用。

三、羥喜樹堿的分離與純化：

A.經微生物轉化后的喜樹細胞培養物中羥喜樹堿的提取：