[發明專利]羥喜樹堿的微生物轉化制備方法

無效

• 申請號: 200910010745.5
• 申請日: 2009-03-19
• 公開（公告）號: CN101509023A
• 公開（公告）日: 2009-08-19
• 發明（設計）人: 姜波;王賀雙;高華;張涓涓;畢靜;郝爽
• 申請（專利權）人: 大連理工大學
• 主分類號: C12P17/18
• 分類號: C12P17/18;C12R1/67;C12R1/845
• 代理公司: 大連八方知識產權代理有限公司
• 代理人: 高 杰

1.羥喜樹堿的微生物轉化制備方法，其特征在于，以喜樹的幼莖為外植體，將在固體培養基上誘導、并繼代的喜樹愈傷組織轉入液體培養基中，進行喜樹細胞懸浮培養，再接種微生物培養轉化；然后經提取、析晶、柱層析、結晶等方法分離純化經微生物轉化后的喜樹細胞培養物中羥喜樹堿，步驟如下：

一、喜樹細胞培養系的建立：

A、喜樹愈傷組織的誘導和繼代培養：

喜樹愈傷組織的誘導和繼代培養是在光照培養箱中進行的，光照8-10小時/天，培養溫度為20～35℃，培養3～10天，喜樹愈傷組織每隔3～15天繼代一次，繼代3～10次。

作為誘導、繼代培養喜樹愈傷組織的固體培養基，其基本培養基為MS培養基，其中附加了1.0～1.5mg/l6-芐基腺嘌呤，2～60g/l蔗糖，1～15g/l尿素，0.6～0.9mg/l?2，4-二氯苯氧乙酸，凝固劑為瓊脂6g/l，pH為5.5～6.5；

B、喜樹細胞培養懸浮系建立：

將A步培養好的喜樹愈傷組織轉入通氣量為0.1～0.5l/min的氣升式內環流反應器中培養，溫度為20～35℃，喜樹細胞培養每隔3～15天繼代一次；

進行懸浮培養的液體培養基，其基本培養基為MS培養基，其中附加1.0～1.5mg/l?6-芐基腺嘌呤，2～60g/l蔗糖，1～15g/l尿素，0.6～0.9mg/l?2，4-二氯苯氧乙酸，pH為5.5～6.5；

喜樹細胞培養周期為5～25天；

二、微生物對懸浮培養喜樹細胞的生物轉化：

A.喜樹細胞的懸浮培養及微生物的接種：

無毒黃曲霉Cr-1菌株(Aspergillus.flavus)和根霉T-34菌株(Rhizopus?sp.)的接種：于喜樹細胞培養期的第5～25天接種1％～2％的無毒黃曲霉Cr-1菌株(Aspergillus.flavus)，相距1～100小時后接種1％～2％的根霉T-34菌株(Rhizopus?sp.)；

B.微生物的培養轉化條件：

初始PH值為5.5～6.5，溫度為25～35℃，在接種根霉T-34菌株(Rhizopus?sp.)后再培養轉化1～240小時；

C、喜樹細胞培養物的收獲：

喜樹細胞培養物收獲后，用清水沖洗干凈，減壓抽濾去除殘液后置于恒溫干燥箱中，50～80℃烘干至恒重，磨成粗粉，備用；

三、羥喜樹堿的分離與純化：

A.經微生物轉化后的喜樹細胞培養物中羥喜樹堿的提取：

以乙醇為提取液，采用連續回流提取，在80～95℃水浴中，提取喜樹細胞培養物粉末內的羥喜樹堿，得到含有羥喜樹堿的提取液；

B.濃縮、析晶：

提取液經減壓濃縮至1/15體積，趁熱過濾，靜置放冷，析晶后過濾，晶體備用；濾液真空揮干溶劑，以少量熱乙醇溶解，靜置放冷，析晶；合并晶體以熱乙醇重結晶，結晶體用甲醇∶三氯甲烷＝1∶5(V/V)的溶劑溶解，得到含有羥喜樹堿的溶液；

C.硅膠柱對結晶溶液的再分離：

硅膠柱分別以三氯甲烷、甲醇∶三氯甲烷＝0.3∶100(V/V)、甲醇∶三氯甲烷＝1.3∶100(V/V)依次梯度洗脫，收集甲醇∶三氯甲烷＝1.3∶100(V/V)洗脫液，得到含有羥喜樹堿的洗脫液；

D.對洗脫液的再結晶：

減壓回收溶劑至干，分別以無水乙醇和甲醇∶三氯甲烷＝0.1∶100(V/V)兩種溶液結晶，其中甲醇∶三氯甲烷＝0.1∶100(V/V)溶液結晶得到羥喜樹堿純品。