[發(fā)明專利]一株兼性厭氧海洋施氏假單胞菌的活性提取物及其制法和用途無效
| 申請?zhí)枺?/td> | 200910010499.3 | 申請日： | 2009-02-26 |
| 公開（公告）號： | CN101496820A | 公開（公告）日： | 2009-08-05 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 穆軍;顧曉潔;張翼;付步飛;董學(xué)偉 | 申請（專利權(quán)）人： | 大連交通大學(xué) |
| 主分類號： | A61K35/74 | 分類號： | A61K35/74;A61P31/04;C12P1/04 |
| 代理公司： | 大連東方專利代理有限責(zé)任公司 | 代理人： | 賈漢生 |
| 地址： | 116028遼寧*** | 國省代碼： | 遼寧;21 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一株兼性厭氧 海洋 施氏假單胞菌 活性 提取物 及其 制法 用途 | ||
1.一株兼性厭氧海洋施氏假單胞菌DN7?CGMCC?No.2732培養(yǎng)液的活性 提取物，所述的提取物是所述菌株在缺氧培養(yǎng)條件下培養(yǎng)物的正丁醇提取物， 對銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌有抗性；通過如下方法制備：
A.種子培養(yǎng)：將液體培養(yǎng)基灌裝到血清瓶中，瓶中留2cm高的空隙，血 清瓶蓋微旋緊以利透氣，于高壓消毒器中121℃、0.105Mpa滅菌20min；冷 卻后接種海洋菌株DN7，并用無菌培養(yǎng)基補滿，瓶蓋旋緊不透氣；將血清瓶置 于恒溫培養(yǎng)箱中35～37℃下培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為10～15天；
B.擴大培養(yǎng)：按體積比5～10%的種子培養(yǎng)液接種，利用密封培養(yǎng)容器， 采取類同種子培養(yǎng)的過程大量培養(yǎng)海洋菌株DN7菌液，于恒溫培養(yǎng)箱中35～37 ℃下培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為15～20天；
所述種子培養(yǎng)和擴大培養(yǎng)中，液體培養(yǎng)基組成為：
用濃度為0.1～0.5mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)使其pH為7.2±0.2；
C.提取：將完成擴大培養(yǎng)過程的菌液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于50℃減壓濃縮至原 體積的十分之一，濃縮液過濾，濾液依次分別用等體積的乙酸乙酯、正丁醇連 續(xù)抽提3次，將正丁醇提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于50℃減壓蒸干，得一份干固體；
D.提純：將上述干固體分別滴加少量甲醇溶解，點樣于分析型硅膠薄層 板上，選用體積比為二氯甲烷：甲醇：三乙胺=3：1：0.02的展開劑展開，采 用薄層層析生物自顯影活性測試法和紙片法追蹤活性斑點；再將樣品分別點樣 于制備型硅膠薄層板，用上述展開劑展開，將活性條帶刮下，用甲醇洗脫；洗 脫相蒸干后通過HPLC進一步純化，使用C18反相柱，用體積濃度為5～100% 的甲醇水作為流動相，進行30分鐘梯度洗脫，再用100%甲醇洗脫20分鐘， 檢測254nm紫外吸收，通過逐步活性追蹤，制備出活性峰組分，將含活性組 分的洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸干，得兩份白色粉末。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海洋菌株DN7培養(yǎng)液的活性提取物的制備方法， 其特征在于包括下列步驟：
A.種子培養(yǎng)：將液體培養(yǎng)基灌裝到血清瓶中，瓶中留2cm高的空隙，血 清瓶蓋微旋緊以利透氣，于高壓消毒器中121℃、0.105Mpa滅菌20min；冷 卻后接種海洋菌株DN7，并用無菌培養(yǎng)基補滿，瓶蓋旋緊不透氣；將血清瓶置 于恒溫培養(yǎng)箱中35～37℃下培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為10～15天；
B.擴大培養(yǎng)：按體積比5～10%的種子培養(yǎng)液接種，利用密封培養(yǎng)容器， 采取類同種子培養(yǎng)的過程大量培養(yǎng)海洋菌株DN7菌液，于恒溫培養(yǎng)箱中35～37 ℃下培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為15～20天；
所述種子培養(yǎng)和擴大培養(yǎng)中，液體培養(yǎng)基組成為：
用濃度為0.1～0.5mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)使其pH為7.2±0.2；
C.提取：將完成擴大培養(yǎng)過程的菌液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于50℃減壓濃縮至原 體積的十分之一，濃縮液過濾，濾液依次分別用等體積的乙酸乙酯、正丁醇連 續(xù)抽提3次，將正丁醇提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于50℃減壓蒸干，得一份干固體；
D.提純：將上述干固體分別滴加少量甲醇溶解，點樣于分析型硅膠薄層 板上，選用體積比為二氯甲烷：甲醇：三乙胺=3：1：0.02的展開劑展開，采 用薄層層析生物自顯影活性測試法和紙片法追蹤活性斑點；再將樣品分別點樣 于制備型硅膠薄層板，用上述展開劑展開，將活性條帶刮下，用甲醇洗脫；洗 脫相蒸干后通過HPLC進一步純化，使用C18反相柱，用體積濃度為5～100% 的甲醇水作為流動相，進行30分鐘梯度洗脫，再用100%甲醇洗脫20分鐘， 檢測254nm紫外吸收，通過逐步活性追蹤，制備出活性峰組分，將含活性組 分的洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸干，得兩份白色粉末。
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