[發(fā)明專利]一種高靈敏度的利用基因突變酵母細(xì)胞篩選抗朊病毒藥物的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910010219.9
• 申請日: 2009-01-21
• 公開（公告）號: CN101481729A
• 公開（公告）日: 2009-07-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 宋有濤;宋堯;李輝
• 申請（專利權(quán)）人: 遼寧大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/18
• 分類號: C12Q1/18;C12R1/865
• 代理公司: 沈陽杰克知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 楊 華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種利用酵母細(xì)胞篩選抗朊病毒藥物的方法。特別涉及到的是 利用基因定點突變酵母細(xì)胞高靈敏度的篩選抗朊病毒藥物的方法。

背景技術(shù)

朊病毒是一類能在動物和人中引起可傳染性腦病(包括瘋牛病、羊搔癢癥、 庫魯病、克雅氏病等)的病原體，其高度傳染性和致死性對整個社會造成了極 大的危害。目前，全世界的研究者們正致力于尋求建立高通量抗朊病毒藥物篩 選平臺的研究，從而盡快研發(fā)出預(yù)防和治療朊病毒引發(fā)疾病的藥物。

目前，在美國和歐洲有關(guān)抗朊病毒藥物的研發(fā)領(lǐng)域中，主要利用動物細(xì)胞 模型來篩選抗朊病毒的藥物。但是由于這個篩選系統(tǒng)技術(shù)上的復(fù)雜性，只能局 限在少數(shù)化合物中進(jìn)行；更重要的是，由于這個篩選系統(tǒng)的實驗成本過于昂貴， 又具有哺乳類動物內(nèi)朊病毒交叉?zhèn)魅镜奈ｋU性，需要P3級以上的無菌實驗室和 大量的高級技術(shù)人員的工作才能保證藥物篩選的進(jìn)行，使得大規(guī)模的在已知化 合物的范疇內(nèi)篩選抗朊病毒藥物缺乏實用的可能性。最近的研究表明，建立在 野生型釀酒酵母細(xì)胞(Saccharomyces?cerevisiae)上的抗朊病毒藥物篩選模型在 很大的程度上可以取代動物細(xì)胞模型，并且具有經(jīng)濟(jì)、簡單、安全的特性。但 是野生型酵母細(xì)胞作為抗朊病毒藥物篩選模型仍存在著缺陷和不足：由于對藥 物的敏感度較低，使得待測藥物用量較大，并容易造成藥物篩選時假陰性過高， 可能漏篩某些溫和型的抗朊病毒的藥物。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述問題，本發(fā)明根據(jù)野生型釀酒酵母細(xì)胞(Saccharomvces cerevisiae)中分子伴侶Ssalp對于朊病毒[PSI⁺]的調(diào)控機(jī)理，通過基因定點突變 酵母細(xì)胞內(nèi)分子伴侶SSA1基因，提供一個高靈敏度的抗朊病毒藥物篩選的酵母 細(xì)胞模型，從而降低待測藥物用量，降低藥物篩選時假陰性的比率，使得能在 更大的范圍內(nèi)高通量篩選抗朊病毒藥物。

本發(fā)明選用的菌種是野生型釀酒酵母細(xì)胞(Saccharomyces?cerevisiae)來自 于美國標(biāo)準(zhǔn)菌種庫(American?Type?Culture?Collection，ATCC)，保藏編號為 208719。這種釀酒酵母帶有[PSI⁺]朊病毒，固體菌落顏色為白色。

本發(fā)明的技術(shù)方案是基于分子水平的朊病毒的致病機(jī)理，以及細(xì)胞內(nèi)分子 伴侶在朊病毒的形成過程中的調(diào)控作用原理，使用基因突變技術(shù)改造了野生型 酵母細(xì)胞對抗朊病毒藥物敏感度低的缺陷。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種高靈敏度的利用基因突變酵母細(xì)胞篩選抗 朊病毒藥物的方法，步驟如下：

1)SSA1-YS1酵母細(xì)胞的制備：

將野生型釀酒酵母細(xì)胞(Saccharomyces?cerevisiae)內(nèi)的分子伴侶SSA1基因 編碼的第483位亮氨酸突變?yōu)樯彼幔玫交蛲蛔冃蚐SA1-YS1酵母細(xì)胞，其菌 落顏色為粉色；

2)篩選抗朊病毒藥物：

SSA1-YS1酵母細(xì)胞的活化：取SSA1-YS1酵母細(xì)胞接入1/2YPD培養(yǎng)液中，30℃ 振蕩過夜培養(yǎng)；

SSA1-YS1酵母細(xì)胞初始OD值的調(diào)試：調(diào)制SSA1-YS1酵母細(xì)胞懸液 OD₆₀₀＝0.5；

篩選待測藥物：取無菌凍存管，分別加入待測藥物、1/2YPD培養(yǎng)液以及調(diào) 試好的SSA1-YS1酵母細(xì)胞懸液，在24℃的條件下，振蕩培養(yǎng)，每天定時取前一 天凍存管中的SSA1-YS1酵母細(xì)胞放入新的裝有1/2YPD培養(yǎng)液和待測藥物的無菌 凍存管中，振蕩培養(yǎng)1～5天；

檢測：從第一天起，隔天提取100μl前一天的凍存管中的SSA1-YS1酵母細(xì)胞 懸液，稀釋后，在1/2YPD固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上涂布；將涂好SSA1-YS1酵母細(xì) 胞懸液的培養(yǎng)皿置于24℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，再轉(zhuǎn)入4℃冰箱中培養(yǎng)7天，觀 察SSA1-YS1酵母細(xì)胞的顏色。

通過SSA1-YS1酵母菌落顏色的變化觀察待測藥物對于朊病毒的治療效果： 菌落(即SSA1-YS1酵母細(xì)胞)為紅色表示該待測藥物具有抗朊病毒的作用，菌 落仍為粉色表示該待測藥物對于朊病毒無作用。計算該待測藥物對朊病毒[PSI⁺] 的治愈率：愈率＝變紅的菌落數(shù)/總的菌落數(shù)×100％。