[發明專利]牙鲆紅細胞外膜蛋白的制備方法

無效

• 申請號: 200910010092.0
• 申請日: 2009-01-13
• 公開（公告）號: CN101463071A
• 公開（公告）日: 2009-06-24
• 發明（設計）人: 張振冬;王淑芬;鄒亞男;張偉
• 申請（專利權）人: 張振冬
• 主分類號: C07K1/14
• 分類號: C07K1/14;C07K14/46;C07K14/705
• 代理公司: 大連東方專利代理有限責任公司
• 代理人: 賈漢生

技術領域

本發明涉及魚類紅細胞的采集處理和紅細胞外膜蛋白制備技術領域。

背景技術

牙鲆在我國俗稱牙片、偏口，品種優良，生長快速，肉質鮮美，是我國優良的海水魚類增養殖品種之一。目前隨著牙鲆養殖業的發展，養殖規模的擴大，養殖牙鲆各種病害頻繁爆發，造成了巨大的經濟損失。魚類具備一個相對完善的免疫系統，可通過特異性和非特異性免疫來防御各種病原的侵襲。外周血細胞是魚類非特異性免疫防御體系中的重要防線之一^1，2。但是有關魚類紅細胞免疫功能以及紅細胞免疫分子的研究尚未見明確報道，對于牙鲆紅細胞外膜蛋白的制備技術仍屬空白。

目前針對魚類紅細胞免疫功能和紅細胞外膜蛋白的研究，存在以下幾個問題：

1.魚類紅細胞的免疫功能沒有引起研究人員的重視

一般認為，紅細胞的主要功能是攜帶O₂和CO₂，但是1981年Siegel提出了“紅細胞免疫系統的新概念，促進了紅細胞免疫研究發展³。這些工作在人類以及其他哺乳類和鳥類中開展最多，但在魚類中有關紅細胞免疫的報道很少，認識不夠。

2.有關魚類紅細胞免疫機理的研究基礎薄弱

對于魚類紅細胞免疫功能的作用機理尚不了解，參與免疫反應的重要分子和作用方式也未查明，缺乏對紅細胞免疫分子的深入分析和鑒定，無從下手開展研究。

3.有關魚類紅細胞外膜蛋白的制備未見報道

目前有關細胞膜蛋白的研究多集中于高等脊椎動物，而有關低等的魚類細胞膜的研究還未見報道⁴。

參考文獻

1.周永燦，邢玉娜，馮全英.魚類血細胞研究進展.海南大學學報(自然科學版)，2003，21(2)：171-176。

2.邢婧，戰文斌，曾曉華等.牙鲆(Paralichthys?olivaceus)紅細胞單克隆抗體與五種養殖魚類血細胞的交叉反應.海洋與湖沼，200536(2)：123-129。

3.Siegel?I，LiuT?L，Gleicher?N.The?red-cell?immune?system.Lancet.198112；2(8246)：556-9。

4.張領兵，倫艷妮，于樂洋等SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳與液質聯用技術分離和鑒定小鼠巨噬細胞膜蛋白.中國生物工程雜志，2007，27(4)：77-82。

發明內容

本方法的主要原理：根據外周血不同類型細胞的密度不同，選用合適比重的分離液將紅細胞從外周血細胞中分離出來獲得單一組分，從而排除其他細胞的影響。利用添加了蛋白酶抑制劑的低滲溶液溶脹紅細胞獲得細胞膜組分，再通過溫和的膜蛋白裂解液以及冰浴渦旋攪拌的方式，將膜蛋白成分提取出來。

本發明是在經過實驗摸索優化實驗條件和流程，建立了牙鲆紅細胞外膜蛋白的制備技術，技術方案如下：

(1)用5mL一次性無菌注射器分別從4條體長20cm左右的實驗牙鲆的尾靜脈取血，采用阿氏抗凝劑與牙鲆外周血1:1～1.5混合。收集抗凝血冰盒中暫存。

(2)利用比重為1.08～1.09的淋巴細胞分離液分離牙鲆外周血中的紅細胞。將抗凝血用0.1M?PBS緩沖液1:1稀釋，與淋巴細胞分離液按1：2比例混合，于4℃條件下3000rpm水平離心15min。離心后外周血細胞分為4層，小心吸走上層的分離液、白細胞和血漿，將底層的紅細胞沉淀用0.1M?PBS緩沖液4℃離心洗滌3次，去除上清液。

(3)向紅細胞沉淀中加入20倍體積的低滲緩沖液，置于4℃條件下30min，使紅細胞充分溶脹破膜。4℃條件下，12000rpm離心15min收集牙鲆紅細胞膜沉淀。

(4)向紅細胞膜沉淀中加入10～15mL低滲緩沖液，用漩渦混合器將紅細胞膜沉淀打散，4℃條件下12000rpm，15min離心，得到經洗滌的紅細胞膜沉淀。重復上述洗滌步驟2～4次。

(5)向牙鲆紅細胞膜沉淀中加入2～3倍體積的膜蛋白裂解液，磁力攪拌過夜，以充分裂解牙鲆紅細胞膜。裂解過程于冰浴中進行。

(6)裂解后所得溶液于4℃下，12000rpm離心30min，上清液即為牙鲆紅細胞膜蛋白提取液。分裝后于-80℃冰箱中保存。利用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測牙鲆細胞膜蛋白提取液的蛋白濃度。

本制備方法相比與現有文獻中描述的方法程序更為簡單，效率更好，既保證了膜蛋白制備的高效性，又保持了膜蛋白的生物活性。

附圖說明