[發(fā)明專利]牙鲆紅細胞外膜蛋白的制備方法無效
| 申請?zhí)枺?/td> | 200910010092.0 | 申請日： | 2009-01-13 |
| 公開（公告）號： | CN101463071A | 公開（公告）日： | 2009-06-24 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 張振冬;王淑芬;鄒亞男;張偉 | 申請（專利權(quán)）人： | 張振冬 |
| 主分類號： | C07K1/14 | 分類號： | C07K1/14;C07K14/46;C07K14/705 |
| 代理公司： | 大連東方專利代理有限責任公司 | 代理人： | 賈漢生 |
| 地址： | 116023遼寧省大連市沙*** | 國省代碼： | 遼寧;21 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 紅細胞 膜蛋白 制備 方法 | ||
1.牙鲆紅細胞外膜蛋白的制備方法，其特征在于操作步驟為：
(1)用5mL一次性無菌注射器分別從4條體長20cm左右的實驗牙鲆的尾靜脈取血，采用阿氏抗凝劑與牙鲆外周血1:1～1.5混合，收集抗凝血冰盒中暫存；
(2)將抗凝血用0.1M?PBS緩沖液1:1稀釋，與比重為1.08～1.09的淋巴細胞分離液按1：2比例混合，于4℃條件下3000rpm水平離心15min；離心后外周血細胞分為4層，小心吸走上層的分離液、白細胞和血漿，將底層的紅細胞沉淀用0.1M?PBS緩沖液4℃離心洗滌3次，去除上清液；
(3)向紅細胞沉淀中加入20倍體積的低滲緩沖液，置于4℃條件下30min，使紅細胞充分溶脹破膜，4℃條件下，12000rpm離心15min收集牙鲆紅細胞膜沉淀；
(4)向紅細胞膜沉淀中加入10～15mL低滲緩沖液，用漩渦混合器將紅細胞膜沉淀打散，4℃條件下12000rpm，15min離心，得到經(jīng)洗滌的紅細胞膜沉淀，重復(fù)上述洗滌步驟2～4次；
(5)向牙鲆紅細胞膜沉淀中加入2～3倍體積的膜蛋白裂解液，磁力攪拌過夜，以充分裂解牙鲆紅細胞膜，裂解過程于冰浴中進行；
(6)裂解后所得溶液于4℃下，12000rpm離心30min，上清即為牙鲆紅細胞膜蛋白提取液，分裝后于-80℃冰箱中保存，利用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測牙鲆細胞膜蛋白提取液的蛋白濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述牙鲆紅細胞外膜蛋白的制備方法，其特征在于使用的專用液配方為：
(1)低滲緩沖液：
5mM?pH7.8的PBS緩沖液，0.5mM?EDTA，1μg/mL抑肽酶；
(2)膜蛋白裂解液：
50mM?pH7.8的Tris-HCl，150mM?NaCl，1％?Triton?X-100，0.1％?SDS，1mM苯甲基磺酰氟，1μg/mL?Aprotinin，1％?NP?40，0.5％去氧膽酸鈉，5mMPBS，0.5mM?EDTA，0.85％生理鹽水；
(3)阿氏抗凝劑液：
葡萄糖2.05g，檸檬酸鈉0.8g，檸檬酸0.055g，氯化鈉0.42g，加蒸餾水至100mL，加熱溶解后將pH值調(diào)到6.1，經(jīng)8磅(115℃)，15分鐘的高壓滅菌后分裝。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述牙鲆紅細胞外膜蛋白的制備方法，其特征在于操作步驟(4)中用低滲緩沖液重復(fù)洗滌步驟3次。
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