[發明專利]一種用于水果保鮮的特異性卵黃抗體制劑、制備方法及應用

無效

• 申請號: 200910010039.0
• 申請日: 2009-01-07
• 公開（公告）號: CN101455235A
• 公開（公告）日: 2009-06-17
• 發明（設計）人: 金禮吉;韓麗麗;徐永平;李曉宇;尤建嵩;王林會;鄒棟良;陸燕;續繁星;王妮;巨文娜
• 申請（專利權）人: 大連理工大學
• 主分類號: A23B7/16
• 分類號: A23B7/16;A23B7/154;C07K16/14;C07K16/12;C07K16/02;C12R1/83
• 代理公司: 大連理工大學專利中心
• 代理人: 梅洪玉

1.?一種用于水果保鮮的特異性卵黃抗體制劑的制備方法，其特征在于：對于要進行保鮮處理的水果，取該水果致腐細菌或真菌中的一種或多種菌體作為免疫原或者將一種或多種菌體與其相應的孢子混合后作為免疫原；對蛋雞進行注射免疫，初免和加強免疫，共計三次；收集免疫后雞蛋，分離并純化特異性卵黃抗體，制備出單價或多價的特異性卵黃抗體制劑；

所述的水果致腐細菌或真菌為擴展青霉菌、葡萄孢屬灰質菌、念珠球菌、鏈格孢屬菌、酒曲霉菌、囊孢菌屬、灰霉菌、漏病真菌、根霉菌、毛霉菌、粘盤孢菌、多生盤長孢菌、果鐮刀叢梗孢菌、芽孢桿菌屬、醋酸桿菌屬、節桿菌屬；

具體步驟如下：

A、菌體的來源和培養：選擇來自腐爛部位分離的細菌或真菌，用培養基

分離培養和擴增培養，經鑒定確認；

B、免疫原制備：前一步驟A得到的菌體制成菌液后經處理與弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑混合，充分乳化，制成弗式完全佐劑疫苗和弗式不完全佐劑疫苗；

C?免疫：初免為弗氏完全佐劑疫苗，二、三免為弗式不完全佐劑疫苗；初免每只雞胸肌注射2到6點，頸部皮下注射1到3點，每點0.1-0.3?ml；初免后2周進行二免，方法同初免，每點免疫劑量增加至0.2?-0.4?ml；二免后2周進行三免，每點免疫劑量增加至0.3?-0.5?ml；

D、特異性卵黃抗體的制備：定期收集免疫后的雞蛋，分離純化特異性卵黃抗體。

2.權利要求1所述的制備方法得到的特異性卵黃抗體制劑的應用，其特征在于：采用0.02-80%制劑配以99.98-20%輔料制成噴霧劑、浸泡液、涂抹液，輔料包括水、殼聚糖、乙酸、甘油和丙二醇，所述的制劑采用權利要求１所述的用于水果保鮮的特異性卵黃抗體制劑。

3.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于如下步驟：?

A、菌體的來源和培養：擴展青霉菌來自櫻桃腐爛部位分離的擴展青霉菌，PDA培養基分離培養和擴增培養，并經鑒定確認為擴展青霉菌；

B、免疫原制備：將25℃條件下PDA培養的擴展青霉菌用磷酸緩沖液懸浮制成菌液于4℃?8000?r/min離心15?min，收集菌體，再用磷酸緩沖液懸浮，調節菌體濃度至10⁸-10¹²?cfu/ml，懸液在80℃下熱激30分鐘滅活，不時搖動，經無菌檢驗合格后分別加入等量弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑，充分乳化后制成擴展青霉菌滅活疫苗；

C、免疫：初免為弗氏完全佐劑疫苗，二、三免為弗氏不完全佐劑疫苗；初免每只雞胸肌注射4點，頸部皮下注射1點，每點0.2?ml；初免后2周進行二免，方法同初免，每點免疫劑量增加至0.3?ml；二免后2周進行三免，每點免疫劑量增加至0.4?ml；

D、抗擴展青霉菌特異性IgY的制備：三免后收集雞蛋，先用清水洗凈蛋表污物，再用0.5%新潔爾滅溶液浸泡消毒20?min，晾干；使用卵黃分離器分離卵黃，去除卵清蛋白和卵黃膜，收集卵黃，加6倍于卵黃體積的蒸餾水，用0.1?M鹽酸調pH至5.0，攪勻后4℃放置過夜，4℃?10000?r/min離心25?min，取上清，經直徑0.45?mm?濾膜過濾，收集的濾液即為水溶性組分；在WSF中緩慢加入?(NH₄)₂SO₄至飽和度為50%，混勻，待完全溶解后置4℃過夜；4℃?10000?r/min離心15?min，棄上清，用去離子水重新懸浮沉淀至原體積，再加入Na₂SO₄至飽和度為14%，混勻，置室溫過夜；25℃?10000?r/min離心15?min，棄上清，用去離子水重新懸浮沉淀至原體積，即為IgY的提取液；經凝膠過濾純化，經SDS-PAGE測得IgY的純度達90%以上，用單向瓊脂擴散法測得IgY含量超過33%，采用酶聯免疫吸附實驗測得特異性IgY效價達1：200000。

4.權利要求3制備得到的抗擴展青霉菌特異性卵黃抗體噴霧劑應用于櫻桃保鮮的方法，其特征在于：抗擴展青霉菌特異性卵黃抗體提取物1.0%，殼聚糖6.0%，乙酸0.75%，甘油2.0%，丙二醇2.0%?，加蒸餾水補充至100%，經微孔濾膜過濾除菌，裝入消毒的噴劑灌中，使用時噴灑在水果表面，晾干貯藏即可。