[發明專利]一種使孢子快速萌發的方法

無效

• 申請號: 200910009352.2
• 申請日: 2009-02-20
• 公開（公告）號: CN101760434A
• 公開（公告）日: 2010-06-30
• 發明（設計）人: 張新春
• 申請（專利權）人: 張新春
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12N3/00;C12R1/645
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種使孢子快速萌發的方法，具體的說是采用改進后的培養皿法進行的孢子培養方法。

背景技術

孢子萌發是植物病理學真菌病害試驗研究中經常用到的手段，比如可以作為鑒定某些真菌性狀的方法，孢子的萌發實驗又是殺菌劑藥效測定的主要方法。同時對于某些病害的接種，也需要大量的孢子。另外在研究病原真菌的生活史，病害的侵染循環及病害的發生和流行條件等，都涉及孢子的萌發問題。因此，如何快速高效的得到高萌發率的孢子，并用這些萌發的孢子來做進一步研究，也是植病研究中重要的手段和方法。本方法是發明人本人在實驗過程中總結出來的一種高通量的高效快速得到病菌萌發孢子的方法。

傳統的孢子萌發方法主要有懸滴法、載玻片上萌發法、培養皿中萌發法、瓊脂平板表面萌發法及其它特殊方法。發明人在實驗中主要采用懸滴法和載玻片萌發法作為比較方法。

發明內容

本發明的目的是提供一種使孢子快速萌發的方法，是一種改進的培養皿法。

本發明的目的是通過以下技術方案來實現：

一種使孢子快速萌發的方法，包括以下步驟：

A、取孢子菌株在PDA培養基上置于28±0.5℃培養箱內進行單孢培養，待菌絲長滿皿后，置于光照下28±0.5℃連續照射至少4天，誘導孢子的產生。

B、用適當量的無菌水沖洗菌落表面，得到孢子液。再用4層紗布過濾得到孢子懸浮液，用無菌水稀釋，使孢子濃度達到10⁵個/ml。

C、參照方中達《植病研究方法》，取配置好的孢子懸浮液進行懸滴法和載玻片萌發法操作實驗。

D、把從步驟B得到的部分孢子懸浮液離心，保留部分上清約100ul，其余上清丟棄，保留孢子備用。

E、無菌條件下，把滅過菌的孔徑為0.45um的透明微孔濾膜平鋪在事先準備好的PDA平板上，使膜與培養基表面緊密接觸，不留空隙。膜大小以剛能全部遮住培養基為準。

F、取離心得到的100ul孢子懸浮液平鋪到濾膜上，用三角玻棒攤勻，用封口膜封口后置于28±0.5℃培養箱培養。

G、培養一定時間后即可在顯微鏡下直接觀察孢子的萌發率，或者用無菌水沖洗萌發的孢子，得到萌發的孢子懸浮液(此過程禁用三角玻棒刮)。經預試驗兩種觀察方法得到的結果一樣，采用觀察孢子懸浮液的方法。

H、所有三種處理都是在培養5h和8h后在顯微鏡下觀察孢子萌發率。每個處理觀察10個視野。其中孢子萌發標準為：以芽管長度超過孢子直徑長度(指直徑最小的一邊)的一半，視為已經萌發的孢子。

本發明的有益效果為：與常用的孢子萌發方法相比，在相同的時間條件下，可以大幅度提高孢子萌發率。

具體實施方式

下面以香蕉枯萎菌和西瓜枯萎菌兩種菌為材料的基礎上，采用載玻片發、懸滴法和本方法進行比較，數據及分析如下：

1、三種方法下，FOC-4R的孢子萌發率比較(表1)

表1，FOC-4R的孢子萌發率

由表1中可以看到，使用三種方法得到的孢子萌發率以對照1的萌發率最低，即使是在處理8h后，也僅能達到6.5％，雖然對照2的萌發率在處理相同時間后達到了39.2％，但與改良的培養皿法高達77.3％的萌發率相比，還是相差甚遠。FOC-4R菌株在使用改良的培養皿發后，無論在處理5h或8h后，孢子的萌發率都顯著高于其它兩種方法。

2、三種方法下，FW的孢子萌發率比較(表2)

表2，FW的孢子萌發率

由表2可知，無論在處理時間和處理方法下，使用對照1的孢子萌發率最低，特別是在處理5h的情況下，僅能達到1.8％，而在同樣條件下，使用了改良方法的孢子其萌發率都是最高的，特別是在處理了8h后，萌發率可以高達92.7％，幾乎全部萌發。FW菌株其孢子萌發率在使用改良的培養皿發后，無論是在處理5h或是8h，其萌發率都顯著高于其它兩種對照方法。

改良的培養皿法是在原有的培養皿方法基礎上改進而來的。發明人在實驗過程中，因為需要萌發率相當高的孢子來做研究，而由于這兩種孢子需要高濕度環境才能萌發。在實驗了現有的幾種孢子萌發方法后，都達不到理想的要求。因此才設計和試驗了這種方法。結果發現，用改良的培養皿法進行孢子萌發實驗，其萌發率可以很容易控制并能達到實驗要求。如果需要全部萌發，對于香蕉枯萎菌4號小種來說，萌發時間控制在10個小時即可。而對于西瓜枯萎菌來說，只要8小時即可。