[發明專利]一種檢測人乳頭瘤病毒中和抗體的方法

無效

• 申請號: 200910001113.2
• 申請日: 2009-01-22
• 公開（公告）號: CN101551392A
• 公開（公告）日: 2009-10-07
• 發明（設計）人: 程通;鄭舟;周國棟;杜海蓮;張軍;夏寧邵
• 申請（專利權）人: 廈門大學;養生堂有限公司
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/68;G01N33/533
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所
• 代理人: 羅菊華

技術領域

本發明涉及人乳頭瘤病毒抗體檢測領域。更具體地，本發明涉及通過聯合應用帶有報告基因的人乳頭瘤病毒假病毒和自動掃描儀器，對人乳頭瘤病毒中和抗體進行檢測的方法。

背景技術

人乳頭瘤病毒(HPV)感染的流行范圍廣，所引發的相關致死性的惡性腫瘤和多種性傳播疾病對人類健康具有嚴重的危害性，開發安全有效的預防或治療性疫苗具有重大意義。針對HPV的中和抗體水平是HPV疫苗研究開發的關鍵性指標，因此建立高效、準確和便捷的中和抗體檢測方法十分重要。然而，由于HPV具有嚴格的宿主特異性，同時其病毒復制與宿主細胞的分化狀態密切相關，目前難于在體外對HPV進行快速高效的組織培養，也缺乏適宜的動物模型。因此探索建立可及時快速鑒定或篩選中和抗體和評估待選疫苗保護性的方法是十分必要的。

目前，已發展出多種不同類型的HPV中和抗體評估方法，如基于免疫缺陷小鼠組織移植模型的評估方法(White?WI等，病毒學雜志，1998年，72卷：959-964頁)、基于體外感染原代上皮組織的評估方法(Meyers?C等，科學，1992年，257卷：971-973頁)、基于HPV類病毒顆粒(VLP)的ELISA方法(1999年，Semin?Cancer?Biol)以及血凝抑制實驗(Roden?RB等，病毒學雜志，1996年，70卷：3298-3301頁)等，但這些方法分別存在操作復雜、效率低、實驗周期長或不能準確反映抗體的中和保護作用等問題。因此，迫切需要發展能夠便捷、有效地檢測HPV中和抗體的方法，同時希望新方法能夠適合于進行高通量的檢測。近來，研究顯示HPV?VLP具有可非特異性包裹質粒核酸的特點，因此可構建攜帶報告質粒的HPV假病毒(HPVpseudovirus)用于體外有效模擬HPV感染過程，并可用于對HPV中和抗體進行快速檢測(Buck?CB等，病毒學雜志，2004年，78卷：751-757頁)?；贖PV假病毒的中和抗體檢測方法相比其它傳統方法具有較為明顯的簡便、效率高的優點，實驗周期縮短，對于不同的HPV亞型具有較好的通用性。目前，基于HPV假病毒的中和抗體檢測方法已得到日益廣泛的應用。

然而隨著研究的深入，對HPV中和抗體檢測提出了更高的要求，除了靈敏度和準確度好外，同時要求能夠更為快速、簡便，能夠更準確地進行客觀的量化檢測以提高重復性。當前基于HPV假病毒的中和抗體檢測方法，主要有2種：(1)以綠色熒光蛋白(GFP)為報告基因，構建帶有GFP報告基因表達元件的HPV假病毒，在感染293TT細胞后用熒光顯微鏡目測或流式細胞儀(FACS)檢測發綠色熒光的細胞(被感染細胞)，通過檢測HPV中和抗體對假病毒感染的阻斷能力評估其效價；(2)以分泌型堿性磷酸酶(SEAP)為報告基因，構建帶有SEAP報告基因表達元件的HPV假病毒，感染293TT細胞后通過離心收集細胞培養上清，之后通過SEAP化學發光檢測試劑盒進行顯色，再用化學發光酶標儀獲得結果，通過檢測HPV中和抗體對假病毒感染的阻斷能力評估其效價。在應用中發現，上述第一種方法的操作較為復雜耗時，需要進行細胞消化操作，然后逐孔用FACS進行檢測，1個96孔板的檢測過程通常需要2至3個小時，耗時費力；第二種方法的操作可使用類似酶標儀的儀器進行快速掃描判定，有利于批量檢測，但其試劑盒成本較高，其主要檢測酶促顯色反應程度，同時這種方法存在靈酶度的問題，細胞在被少量感染時SEAP分泌量低就會存在讀值的陽性/陰性值比(P/N比)低的問題，會影響結果判定。因此為了提高P/N比，就需要使用更大量的假病毒，不利于提高實驗效率。

本發明建立了一種簡單、準確而又高靈敏度的HPV中和抗體檢測方法，可更好地滿足對HPV中和抗體檢測實驗的要求。

發明概述

本發明的目的是建立簡便、有效、高靈酶度的，并且能夠更適合于進行高通量檢測的HPV中和抗體檢測方法。本發明在檢測中引入了具有快速掃描檢測能力的斑點檢測儀器，采用斑點檢測法檢測被HPV或HPV假病毒感染的細胞，同時相應采用了可使被感染細胞產生顏色標記信號以適于應用斑點檢測儀器進行檢測的報告基因，從而組合建立了一種新型高效的HPV中和抗體檢測模式，并將這種模式應用于HPV中和抗體的檢測方法，可用于檢測不同亞型HPV的中和抗體。