[發明專利]高純度馬抗狂犬病毒抗體F(ab')2片段

無效

• 申請號: 200910000966.4
• 申請日: 2009-01-23
• 公開（公告）號: CN101787079A
• 公開（公告）日: 2010-07-28
• 發明（設計）人: 李樹民;王福軍;趙翠波;莘旭妮
• 申請（專利權）人: 軍事醫學科學院軍事獸醫研究所
• 主分類號: C07K16/10
• 分類號: C07K16/10;A61P31/14;C12P21/06;C07K1/36
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

一.技術領域：

本發明涉及一種用于治療、預防狂犬病的高純度馬抗狂犬病抗體F(ab’)2片段純品的制備和純化方法，屬于生物制藥領域。

二.背景技術：

狂犬病是由狂犬病毒引起的致死性人畜共患傳染病，以侵犯中樞神經系統為特征。狂犬病在世界各地分布廣泛，發生普遍，我國是狂犬病的高發區。狂犬病具有致死率非常高的特點，且發病率呈逐年上升趨勢，嚴重的危害了人們的健康。目前防治狂犬病的主要方法是注射狂犬疫苗，雖然對狂犬病能夠有效地預防，但狂犬疫苗需要在咬后24小時內注射，并且個別時候狂犬疫苗也無法對個體進行有效的保護。另外，狂犬病的發病后治療一直是世界性難題，對于嚴重發病者(III)而言，世界衛生組織建議同時使用疫苗和狂犬病毒免疫球蛋白進行主動和被動免疫治療。關于狂犬病毒免疫球蛋白，目前可以選用的有人血來源的抗狂犬病毒免疫球蛋白和馬抗狂犬病毒免疫球蛋白抗血清。

目前人血來源的抗狂犬病毒免疫球蛋白的來源少，價格高，而且血制品中不僅非特異性雜蛋白多，特異性抗體含量很低，并且最大的問題是血源制品潛在的未能檢出的病原污染問題，從長遠考慮不適于臨床的有效應用。

而馬抗免疫球蛋白血清自古以來是用于重要病原體感染的一種有效的應急治療措施，至今至少有7種抗血清在臨床廣泛應用，發揮重要的治療和預防傳染病的作用。目前馬抗狂犬病毒抗體的抗血清產品雖然已經上市，并且在預防和治療狂犬病方面有一定的效果，但目前該產品或者是僅僅通過酶切而未去除Fc片段，造成對人的免疫原性過強；或者是去除Fc片段不徹底，產品中有少量Fc片段的殘留，所以導致實際應用中容易過敏，大大限制了其臨床應用。

鑒于此，本發明通過一系列的處理步驟結合層析的方法對F(ab’)2片段進行了精純化，有效地解決了由于Fc片段的殘留引起過敏的問題，使抗狂犬病毒抗體F(ab’)2片段純品中F(ab’)2的含量大于99％，白蛋白的含量檢測不出，抗體效價大于500U/mL。

動物試驗表明本品無過敏性，極大地提高了本品的安全性。另一方面，本項目采用了細胞因子輔助佐劑，大大提高了馬匹免疫后產生抗體的效價，降低了本品的制備成本。

三.發明內容：

本發明的目的在于公開一種制備并得到高純度馬抗狂犬病毒免疫球蛋白F(ab’)2片段的方法。

本發明馬抗狂犬病毒抗體F(ab’)2片段的制備方法包括以下步驟：

1)使用狂犬病毒疫苗加入不完全福氏佐劑乳化制備免疫原，并配合干擾素α-2a和白細胞介素2，采用多點免疫馬匹，免疫三次、間隔10天免疫一次。

2)采集馬抗狂犬病毒血漿，用生理鹽水稀釋1倍并加入20％飽和度硫酸銨混勻、離心棄沉淀，上清再加入10％飽和度硫酸銨混勻離心，收集沉淀。沉淀用20mM?PB，pH7.4溶解。

使用中空纖維超濾柱，截留分子量為50kD，進行濃縮，采用20mMPB，pH7.4，0.15M?NaCl對濃縮后的蛋白溶液進行換液，得到馬抗狂犬病毒IgG。

3)馬抗狂犬病毒IgG用稀鹽酸調PH至4.5后使用胃蛋白酶進行酶切，然后用2mol/L?Tris-HCl，pH8.0調PH值至pH7.4，加熱58℃、30min，離心10000rpm，20min去沉淀的Fc段，上清為初步純化的馬抗狂犬病毒抗體F(ab’)2片段。

4)初步純化的馬抗狂犬病毒抗體F(ab’)2使用Q?Sepharose?FastFlow，用20mM?PB，pH7.4平衡，上一步得到的樣品稀釋后上樣，再次平衡后用20mM?PB，pH7.4，0～0.5M?NaCl梯度洗脫，得到進一步純化的抗狂犬病毒抗體F(ab’)2。

5)使用Sephacryl?S-100High?Resolution層析介質，使用20mMPB，pH7.4，0.15M?NaCl平衡，上一步得到的樣品上樣，平衡，收集目的蛋白峰，即得到純品的抗狂犬病毒抗體F(ab’)2片段。

得到的抗狂犬病毒抗體F(ab’)2片段的含量通過薄層掃描法定量檢測，純度超過了99％。白蛋白含量在瓊脂糖電泳中檢測不出。其抗體效價達到了500IU/mL。

在急性毒性試驗中，小鼠對于本品的最大耐受劑量達到了80mg/kg。在過敏性試驗中，在20mg/kg劑量的情況下，單次使用本品，豚鼠未出現過敏性反應。

綜上所述，本發明中的抗狂犬病毒抗體F(ab’)2片段安全有效，有望成為一種有效治療和預防狂犬病的藥品。

四.具體實施方案：

(一).抗狂犬病毒抗體F(ab’)2純品的制備：