[發明專利]一種耐熱非-K12大腸桿菌植酸酶及其生產

有效

• 申請號: 200880131973.1
• 申請日: 2008-11-14
• 公開（公告）號: CN102209785A
• 公開（公告）日: 2011-10-05
• 發明（設計）人: 葉秀云;李仁寬;靳偉剛;陳彩芳
• 申請（專利權）人: 福建福大百特科技發展有限公司
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N15/63;C12N9/16
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 余穎

技術領域

本發明涉及分子生物學、生物化學、及植酸酶的發酵和后加工等領域。更確切的說，本發明涉及一種新的非-K12大腸桿菌基因編碼的耐熱植酸酶的克隆和表達。

技術背景

植酸酶(肌型肌醇-六磷酸鹽磷酸水解酶，EC?3.1.3.8)是一種能夠將植酸(肌型肌醇-六磷酸鹽)水解為肌醇和無機磷的酶。眾所周知植酸酶是很有價值的飼料添加劑。20世紀末，植酸酶作為動物飼料添加劑的年銷售額估計超過一億五千萬美元，并且還在逐步增加。

目前，禽、豬日糧以谷類、豆類和油籽產品為主。這些飼料中所含有的磷約有三分之二以植酸和植酸鹽的形式存在。植物中的植酸磷是鈣-鎂-鉀植酸鹽的混合物，其以螯合物的形式存在，溶解度很低。這種形式的磷很難被人、豬、禽等單胃動物所消化。

使用植酸酶水解植酸中鍵合磷基團的酯鍵，可以提高植酸磷以及結合在植酸復合物中的礦物質和微量元素的利用率。植酸酶是一種特殊的磷酸酶，其能夠水解植酸成為一系列肌醇和磷酸鹽的低磷酸酯。已知的植酸酶有兩種類型：3-植酸酶和6-植酸酶，以其首先易于攻擊的磷酸酯鍵的位置作為區別。雖然單胃動物缺乏能有效利用植酸磷的足夠的植酸酶，但是很多真菌、細菌和酵母能生產植酸酶，并可用于對動物口糧進行補充。

補充植酸酶能夠有效提高磷消化率，這已經在動物實驗中得到了很好的證明(Mroz?et?al.，1994；Kornegay?et?al.，1996；Rao?et?al.，1999；Ravindran?et?al.，1999)。所使用的酶的功效，不僅取決于酶的類型、反應速率和存在的酶活力水平，還取決于酶在通過胃腸道時所遇到的不同環境中，以及在食品或飼料制劑預處理時所采用的條件下保持其活性的能力。

雖然有眾多的植酸酶可用于添加劑，但是很多酶都存在一定的缺陷。例如，許多目前使用的植酸酶在飼料造粒過程中由于熱處理會喪失其活性。另外，許多目前使用的植酸酶對動物消化系統中的胃蛋白酶和胰蛋白酶等沒有足夠的抗性。

因此，迫切需要可用于動物飼料和食品加工的優良性質的植酸酶產品。

發明概述

一方面，本發明提供一個分離的核酸分子，其包含一個選自以下組中的核酸序列：

a)一個核酸序列所編碼的多肽，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：3所示；

b)一個在嚴格的雜交條件下與a)中的序列所雜交的核酸序列，其所述核酸序列編碼有非-K12大腸桿菌植酸酶活性的多肽；或

c)一個與a)或b)中的序列互補的核酸序列；

在本發明的一個實施例中，所分離的核酸分子含有一個選自以下組中的核酸序列：

a)一個核酸序列，其組成核苷酸67-1296如SEQ?ID?NO：1所示；

b)一個核酸序列，其組成核苷酸1-1230如SEQ?ID?NO：2所示；

c)一個如SEQ?ID?NO：4所示的核苷酸序列；

d)一個在嚴格條件下與a)到c)中任一個所雜交的核酸序列，其編碼有非-K12大腸桿菌植酸酶活性的多肽；或

e)一個與a)到d)中任一個所互補的核酸序列。

另一方面，本發明提供一個載體，其包含本發明所分離的核酸分子，優選的，所述的載體是一個表達載體。例如，所述載體可以選自下組中：pTrcHis2-PhE，pPIC9K-PhE，pMET-PhE和pKLAC-PhE。

另一方面，本發明提供一個分離的細胞，其包含本發明中所述的分離的核酸分子，優選的，所述的分離的核酸分子是一個組成的表達載體。優選的，所述的細胞是酵母細胞。例如，所述的細胞可以選擇大腸桿菌(Escherichia?coli.)，畢氏酵母(Pichia?pastoris)，甲醇酵母(Pichia?methanolica)和克魯維乳酸酵母(Kluyeromyces?lactis)。更具體的說，所述細胞可以選擇E.coli?MG1655，P.pastoris?GS115，P.methanolica?PMAD16和Kluyeromyces?lactis?GG799。在本發明的一個實施例中，所選擇的細胞包括：轉化有重組質粒pTrcHis2-PhE的E.coli?MG1655，轉化有重組質粒pPIC9K-PhE的P.pastoris?SMD1168，轉化有重組質粒pMET-PhE的P.methanolica?PMD16和轉化有重組質粒pKLAC-PhE的Kluyeromyces?lactis?GG799。

另一方面，本發明提供一個多肽，其包含一個選自以下組中的氨基酸序列：

a)一個如SEQ?ID?NO：3所示的氨基酸序列；或