[發明專利]利用超聲處理使絲纖蛋白凝膠化的方法

有效

• 申請號: 200880100926.0
• 申請日: 2008-05-29
• 公開（公告）號: CN101772348A
• 公開（公告）日: 2010-07-07
• 發明（設計）人: 王曉沁;喬恩·克盧格;加里·G·萊斯克;戴維·L·卡普蘭
• 申請（專利權）人: 塔夫茨大學信托人
• 主分類號: A61K35/24
• 分類號: A61K35/24
• 代理公司: 北京信慧永光知識產權代理有限責任公司 11290
• 代理人: 張淑珍;梁興龍

本發明是在美國國立健康研究院(National?Institutes?of?Health)資助的組織工程研究中心基金號為P41?EB002520的聯邦政府的支持下完成的。美國政府對本發明享有一定的權利。?

相關申請?

本發明涉及2007年5月29日遞交的標題為“Method?for?Silk?FibroinGelation?Using?Sonication”的美國臨時專利申請60/940,554，并要求其優先權，將其并入本文作為參考。?

技術領域

本發明提供了通過超聲處理快速形成絲纖蛋白凝膠化的方法。由本方法形成的水凝膠是有用的，例如用作生物遞送載體(biodelivery?vehicles)。?

背景技術

生物相容且可生物降解的聚合物水凝膠是遞送用于例如在組織工程和受控藥物釋放中的生物醫學應用的生物活性分子和細胞的有用載體。純化的天然絲纖蛋白從水溶液中形成富含β-折疊的交聯水凝膠結構，其方法的細節和凝膠特性受環境參數的影響。對于天然絲纖蛋白水溶液而言，上述的膠凝時間經常需要幾天到幾周，高溫和低pH是造成凝膠化動力學增進的原因。那些條件雖然適于結合某些生物活性分子，但對于活化細胞和不穩定的生物活性分子的結合可能過于緩慢。?

因此，在現有技術中需要一種在溫和的生理條件下快速形成絲纖蛋白凝膠化的方法。?

發明內容

本發明涉及一種快速形成絲纖蛋白凝膠化的方法。本方法將絲纖蛋白進行處理，所述處理包括超聲處理足夠長的一段時間以起始凝膠化。例如在特定條件下，凝膠化發生在超聲處理的24小時內。?

本發明的實施方式還涉及一種控制絲纖蛋白膠凝時間的方法，所述方法通過將絲纖蛋白溶液進行超聲處理足夠長的一段時間以起始凝膠?化。在一個實施例中，所述膠凝時間少于兩個小時。?

另一個實施方式涉及一種在絲纖蛋白中包封藥劑的方法。所述方法包括：將絲纖蛋白溶液進行超聲處理足夠長的一段時間以起始凝膠化，并在所述絲纖蛋白溶液中發生實質上的凝膠化之前，將所述藥劑引入所述絲纖蛋白溶液，從而形成絲纖蛋白包封的藥劑。或者，可在超聲處理之前，將藥劑加入絲纖蛋白中。所述藥劑可為治療劑(例如藥物)或生物材料(例如細胞)。例如，在超聲處理之后，將源自人骨髓的間充質干細胞(hMSC)成功地結合到絲纖蛋白水凝膠中，隨后快速凝膠化并保持細胞功能。?

由本發明方法產生的水凝膠顯示了良好的機械性能和蛋白水解降解表現。例如，超聲處理4％、8％和12％(w/v)的絲纖蛋白溶液，隨后加入hMSC，在0.5小時到2小時內發生凝膠化。所述細胞在4％的凝膠中生長并增殖超過二十一天。另外，可使用低濃度的K⁺和低pH來促進凝膠化。?

附圖說明

圖1描述了在各種超聲處理條件下的絲纖蛋白(SF)凝膠化。使用0.5ml水溶液，以20％振幅進行超聲處理，并且將超聲處理時間由5秒變化到30秒。數值是每組至少N＝3個樣品的平均值±標準偏差。*各組之間具有顯著性差異(Student?t-檢驗，p＜0.01)。?

圖2A-2C描述了在凝膠化過程中，絲β-折疊結構的動力學形成。圖2A顯示在超聲處理120分鐘之后，對超聲處理后的2％(w/v)絲纖蛋白水溶液每8分鐘進行波長掃描來進行圓二色性(CD)測定。圖2B顯示在217nm處(β-折疊結構的峰值)記錄的橢圓率隨時間增加的圖。圖2C是絲凝膠化機理的示意圖。凝膠化過程包含兩個動力學步驟：(a)在短時間內，結構由無規卷曲變為具有一些鏈間物理交聯的β-折疊；(b)β-折疊結構延伸，形成大量的鏈間β-折疊交聯連接，然后在相對長時間內，分子組織成凝膠網狀物。?

圖3A-3C顯示鹽和pH對絲纖蛋白凝膠化的影響。在超聲處理之前，將K⁺(圖3A)和Ca²⁺(圖3B)補充到各種濃度的溶液中至最終濃度20?mM至200mM。圖3C顯示在超聲處理之前調節絲纖蛋白水溶液pH的效果。將所有樣品以20％振幅進行超聲處理15秒。數值為每組至少N＝3個樣品的平均值±標準偏差。^*，◇在各組之間存在顯著性差異(Student?t-檢驗，p＜0.05)。?