[發(fā)明專利]α-1-抗胰蛋白酶和載脂蛋白A-I的純化方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200880025319.2
• 申請(qǐng)日: 2008-08-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101778860A
• 公開(kāi)（公告）日: 2010-07-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: N·布林克曼;D·比格萊爾;R·博利;V·弗奇
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: CSL百靈有限公司
• 主分類號(hào): C07K1/14
• 分類號(hào): C07K1/14;C07K1/16;C07K1/30;C07K1/36;C07K14/775;C07K14/81
• 代理公司: 北京戈程知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11314
• 代理人: 程偉

相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用

本申請(qǐng)要求2007年8月17日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第60/935,527號(hào)的優(yōu)先權(quán)的權(quán) 益，并將其全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用結(jié)合在此。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及來(lái)自(例如)人血漿的一個(gè)部分的α-1-抗胰蛋白酶(AAT，亦稱為 α-1蛋白酶抑制劑、API、以及A₁-PI)和載脂蛋白A-I(ApoA-I)二者的蛋白分離與 純化的方法。在某些具體實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了在純化的最初階段將AAT與 ApoA-I分離的方法，這樣使得同一起始材料能夠被用作對(duì)于這兩種蛋白的來(lái)源。 這些方法進(jìn)一步涉及提供AAT和ApoA-I的組合物，這些組合物適合于藥物的用途 并且適合于大規(guī)模純化。

背景技術(shù)

許多基于蛋白的生物藥劑是從人血漿分離的。原料人血漿(它們部分依賴于 志愿的血液捐贈(zèng))的有限供應(yīng)結(jié)合總體上的低濃度、高脆性、以及在血漿蛋白純 化中的有限的產(chǎn)率使得這種類別的藥物的制造是困難的和昂貴的。因此存在這樣 一種需要：提高血漿蛋白的純化方法的效率，這樣使得能夠以可達(dá)到的最高的產(chǎn) 率從相同的人血漿樣品中分離出盡可能多的醫(yī)學(xué)上有關(guān)的蛋白。

由于蛋白的多樣性、與每種蛋白制品有關(guān)的可能的污染物和/或雜質(zhì)的性質(zhì)改 變、以及對(duì)于生物藥劑的生產(chǎn)通常需要大量的蛋白，因此對(duì)于人血漿蛋白的蛋白 分離與純化的方法提出了獨(dú)特的挑戰(zhàn)。純化技術(shù)總體上包括一系列純化步驟，這 些步驟具有分離一種單一目標(biāo)蛋白的目的。

α-1-抗胰蛋白酶(AAT)和載脂蛋白A-I(ApoA-I)是可以被制成生物藥劑的 人血漿蛋白的實(shí)施例。已經(jīng)說(shuō)明了使用專用的純化工藝來(lái)純化這些蛋白的方法。 例如PCT公開(kāi)號(hào)WO04060528說(shuō)明了一種用于AAT的純化工藝以及美國(guó)專利號(hào) 5,089,602說(shuō)明了ApoA-I的純化，每種工藝開(kāi)始于人血漿部分并且各自得到一種單 一蛋白的產(chǎn)品。

我們現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展了多種方法，這些方法允許從相同的人血漿的部分開(kāi)始的 AAT和ApoA-I的純化。這些方法適合于大規(guī)模純化，因此為工業(yè)上適用的制造過(guò) 程提供了基礎(chǔ)。本發(fā)明提供了用于在純化初期將AAT與ApoA-I分離的方法，這樣 使得同一起始材料能夠被用作一種起始材料來(lái)純化這兩種蛋白；以及在所述分離 之后生產(chǎn)藥物級(jí)的AAT和ApoA-I的方法。

ApoA-I是高密度脂蛋白(HDL)的一種28kDa的主要蛋白組分并且它在為排 泄或再循環(huán)進(jìn)行的從外周至肝臟的膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)中起一種關(guān)鍵作用。

特別在重建的HDL樣顆粒中的ApoA-I長(zhǎng)期以來(lái)已被說(shuō)明為具有治療的潛能。 最近剛發(fā)表的一項(xiàng)研究強(qiáng)調(diào)了這種潛能(JAMA(2007)；vo1.297，p.1675-1682)。

已經(jīng)發(fā)展了多種用于ApoA-I的純化技術(shù)。

小規(guī)模純化ApoA1的最常見(jiàn)的途經(jīng)之一是使用超速離心以便分離HDL，接著 從該HDL-顆粒中分離ApoA-I。存在若干不同的途徑來(lái)從HDL中純化ApoA-I，包括 溶劑提取。超速離心是一項(xiàng)非常耗時(shí)的方法，并且它不適合大規(guī)模的分離。

也已經(jīng)說(shuō)明了不包括超速離心的使用血漿作為起始材料的方法，例如：層析 純化法(Ross?S.E.等人，Rapid?chromatographic?purification?of?apolipoproteins?A-I?and A-II?from?human?plasma，Analytical?Biochemistry?149，p.166-168(1985))以及使用凝 膠過(guò)濾HPLC的純化法(Tricerri?A.等人.，A?rapid?and?efficient?procedure?for?the purification?of?human?apolipoprotein?A-I?using?gel-filtration?HPLC，IJBC，1，p.159-166 (1994))。使用來(lái)自人血漿的冷乙醇分級(jí)分離的部分作為起始材料的其他方法也已 經(jīng)被公布(Peitsch等人，A?purification?method?for?apolipoprotein?A-I?and?A-II， Analytical?Biochemistry，178.p.301-305(1989))。