[發(fā)明專利]G蛋白-寡核苷酸偶聯(lián)物

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200880025180.1
• 申請日: 2008-05-16
• 公開（公告）號: CN101848939A
• 公開（公告）日: 2010-09-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 鄭鳳鉉;程容元;李政玟
• 申請（專利權(quán)）人: 韓國生命工學(xué)研究院
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00
• 代理公司: 永新專利商標代理有限公司 72002
• 代理人: 左路;林曉紅

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及G蛋白偶聯(lián)物(gA-G)，其通過使用連接物將N-末端半胱氨酸標記的G蛋白變體與寡核苷酸相連接而制備，本發(fā)明還涉及制備所述G蛋白偶聯(lián)物的方法，以及通過使用所述偶聯(lián)物制造的生物芯片和生物傳感器。

背景技術(shù)

抗體因其具有特異性結(jié)合抗原的能力而被廣泛用于涉及疾病診斷和治療的醫(yī)學(xué)研究以及生物學(xué)分析中(Curr.Opin.Biotechnol.12(2001)65-69，Curr.Opin.Chem.Biol.5(2001)40-45)。最近，已經(jīng)開發(fā)出了免疫傳感器作為免疫測定法，所述免疫傳感器需要將抗體固定化于固相支持物，以便測量電流、阻抗和質(zhì)量、光學(xué)特性等等的改變(Affinity?Biosensors.vol.7：Techniques?and?protocols)。其中已經(jīng)被商品化的是利用光學(xué)特性的基于表面等離子共振的免疫傳感器。所述基于表面等離子共振的生物傳感器可提供定性信息(兩種分子彼此是否特異性結(jié)合)和定量信息(反應(yīng)動力學(xué)和平衡常數(shù))，還可在不使用標記的情況下進行實時感應(yīng)，因此對于測量抗原一抗體結(jié)合而言特別有用(J.Mol.Recognit.1999，12，390-408)。

在免疫傳感器中，將抗體選擇性地并穩(wěn)定地固定化于固相支持物非常重要。固定化抗體的技術(shù)分為兩類，即物理固定化和化學(xué)固定化。物理固定化技術(shù)(Trends?Anal.Chem.200019，530-540)已經(jīng)極少使用，因為其導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，且結(jié)果的可重復(fù)性較低。相反，化學(xué)固定化技術(shù)(Langumur，1997，13，6485-6490)則因表現(xiàn)出良好的可重復(fù)性和廣泛的用途而被廣泛使用，這是因為其使得蛋白質(zhì)通過形成共價鍵而牢固結(jié)合。不過，當使用化學(xué)固定化技術(shù)固定化抗體時，作為非對稱性大分子的抗體通常會失去其定向和結(jié)合抗原的活性(Analyst?121，29R-32R)。

為了增強抗體結(jié)合抗原的能力，可在抗體被連接至固相基材之前使用支持物，而使用G蛋白作為支持物的技術(shù)是已知的。不過，問題是G蛋白結(jié)合于支持物時其本身也失去定向及其結(jié)合抗體的能力。

因此，為了解決這一問題，已經(jīng)提出了各種各樣的方法。例如，使用2-亞氨基硫烷(2-iminothiolane)處理鏈球菌G蛋白以使得蛋白質(zhì)的氨基酸基團硫醇化，然后將硫醇化的鏈球菌G蛋白固定化于表面。不過，這一方法涉及對具有氨基的氨基酸(Arg，Asn，Gln，Lys)的氨基進行硫醇化，而不是對任何特異性位點進行硫醇化，因此該方法的特異性較低，并在化學(xué)處理后需要額外的純化處理(Biosensors?and?Bioelectronics，2005，21，103-110)。

DNA指導(dǎo)的固定化方法已經(jīng)用于固定化蛋白質(zhì)。已知DNA表面穩(wěn)定，且相對于蛋白質(zhì)芯片而言易于制備。對于蛋白質(zhì)固定化，需要考慮以下因素，例如長期儲存、不穩(wěn)定蛋白質(zhì)的固定化、或在不穩(wěn)定條件下儲存蛋白質(zhì)。DNA指導(dǎo)的抗體固定化方法也已經(jīng)有報道，例如，使用鏈霉抗生物素-DNA偶聯(lián)物固定化生物素酰化抗體的方法，或直接將DNA連接于抗體。不過，這兩種方法的缺點均在于必須將小分子或DNA連接于抗體，因此可導(dǎo)致其失去定向或抗原結(jié)合位點發(fā)生化學(xué)修飾。

發(fā)明內(nèi)容

技術(shù)問題

本發(fā)明的目的在于解決以下問題，即抗體在結(jié)合免疫傳感器后失去其定向的問題，并提供通過使用熟知的DNA表面以恒定的定向?qū)⒖贵w容易地固定化于各種各樣的固相支持物上的技術(shù)。

技術(shù)方案

此前，本發(fā)明人已經(jīng)制備了N-末端半胱氨酸標記的G蛋白變體(韓國專利申請10-2007-0052560)，并通過實驗證實了其有效性，以解決抗體在結(jié)合免疫傳感器后失去其定向的問題。同樣，基于此發(fā)明，本發(fā)明人已經(jīng)通過使用與胺基和硫醇基均能夠發(fā)生選擇性反應(yīng)的連接物將具有胺基的寡核苷酸(gA)與半胱氨酸標記的G蛋白變體相連接而制備了G蛋白偶聯(lián)物(gA-G)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，使用所述G蛋白偶聯(lián)物，能夠以恒定的定向?qū)⒖贵w容易地固定化于各種各樣的固相支持物和表面的所需區(qū)域上，由此完成了本發(fā)明。

附圖說明

圖1顯示了鏈球菌G蛋白與抗體結(jié)合的結(jié)合結(jié)構(gòu)域(B1和B2)。

圖2顯示了用于本發(fā)明的G蛋白變體的結(jié)構(gòu)和B2的氨基酸序列，后者是與抗體結(jié)合的結(jié)構(gòu)域之一。

圖3是蛋白電泳(SDS-PAGE)的照片，顯示了用圖2所示的表達載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌(E.coli)內(nèi)半胱氨酸標記的G蛋白變體的表達模式。