[發明專利]經修飾的人因子VII/VIIa和包含它的藥物組合物

無效

• 申請號: 200880024853.1
• 申請日: 2008-06-12
• 公開（公告）號: CN101743017A
• 公開（公告）日: 2010-06-16
• 發明（設計）人: E·諾尼;S·什圖魯;N·比霍羅
• 申請（專利權）人: LFB生物技術公司
• 主分類號: A61K38/48
• 分類號: A61K38/48;C12N9/64
• 代理公司: 北京市中咨律師事務所 11247
• 代理人: 黃革生;劉金輝

技術領域

本發明的領域涉及要用作藥物活性劑的人因子VII(FVII)/活化的因子VII(FVIIa)的制備。本發明更具體地涉及具有高穩定性的經修飾的因子VII/VIIa，編碼這類經修飾的FVII/VIIa的核酸，及其制備方法。

現有技術

因子VII(FVII)是維生素K依賴性的糖蛋白，其在活化形式(FVIIa)下在存在鈣和組織因子時通過活化因子X和因子IX，參與凝固過程。FVII以具有406個氨基酸殘基的單肽鏈形式分泌，其分子量約為50kDa。FVII包含四個不同的結構域：N-端γ-羧基結構域(Gla)、兩個表皮生長因子樣結構域(EGF-樣)，以及絲氨酸蛋白酶結構域。FVII到FVIIa的活化的特征是Arg152-Ile153鍵(精氨酸152-異亮氨酸153)的切割。因此，FVIIa由分子量約20kDa的152個氨基酸的輕鏈和分子量約30kDa的254個氨基酸的重鏈組成，所述輕鏈和重鏈通過單個二硫鍵(半胱氨酸135-半胱氨酸262)結合在一起。

FVII/VIIa被用于治療患有血友病并遭受因子VIII缺乏(A型血友病)或因子IX缺乏(B型血友病)的患者，以及患有其他凝固因子缺陷(例如可遺傳的FVII缺陷)的患者。FVII/VIIa還被推薦用于治療腦血管意外。

獲得FVIIa濃縮物的最古老方法在于從分級獲得的血漿蛋白質中純化FVIIa。

為此，EP?0?346?241描述了如何制備富含FVIIa的級分，先吸收然后再洗脫血漿蛋白質級分副產物，所述副產物含有FVII和FVIIa和其他蛋白質例如因子IX、X和II，包括PPSB預洗脫物(preeluate)(P＝凝血酶原或FII，P＝轉變素原或FVII，S＝司徒因子(Stuart?factor)或FX，B＝抗血友病B因子或FIX)。

類似地，EP?0?547?932描述了制備高純度FVIIa濃縮物的方法，所述濃縮物基本不含維生素K依賴性因子和FVII。

用于從血漿中獲得FVII/VIIa的這類方法的主要缺點之一是它們僅能夠獲得小量的產物。另一方面，一個主要的缺點是獲得的產物的敏感性，所述產物全身性地提供截短的形式，因此活性較小并且更可能引起不想要的副作用。另外，從捐血者收集的血漿的可用度仍然有限。

為此，編碼人因子VII的DNA早在80年代就被分離(Hagen等(1986)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA；Apr?83(8)：2412-6)，并且相應的蛋白質被表達進BHK哺乳動物細胞(幼倉鼠腎)中(文件EP?0?200?421)。申請人提交的法國申請FR?06?04872也描述了在轉基因動物中生產FVIIa。

這些生產方法能夠獲得免受可能的病毒或其他病原體污染的安全的蛋白質。這類方法能夠獲得下述蛋白質，所述蛋白質的一級序列與人一級序列相同。

重組人FVIIa的商業制劑目前可在商品名(NovoNordisk^TM)下獲得。達到和維持想要的治療或預防效果需要相對高的劑量以及頻繁的靜脈內施用。因此，這類治療對患者而言仍然是限制性的，并且非常昂貴。

另外，已經顯示FVII/VIIa是下述蛋白質，其對蛋白酶切割靈敏，導致形成沒有任何凝固活性的大量分解產物(非典型性切割)。非典型性切割可發生在制備方法的多個步驟中，也可以發生在FVII/VIIa的儲存期間。已觀察了得自血漿的FVII/VIIa的分解產物和使用基因重組步驟產生的FVII/VIIa的分解產物。非典型性切割可在FVII被活化為FVIIa之前涉及，例如在FVII的生產和純化期間涉及，在這樣的活化步驟期間涉及，或者在活化產物(FVIIa)的純化和/或儲存期間涉及。

歐洲專利EP?0?370?036涉及在與FVII/VIIa非典型性切割相關的賴氨酸、精氨酸、異亮氨酸和/或酪氨酸殘基上被修飾的FVII/VIIa，從而減少FVII/VIIa的非典型性切割，從而獲得更穩定的FVII/VIIa。然而，該專利僅部分解決了獲得更穩定的FVII/VIIa的困難，因為其未著眼于非典型性切割相關氨基酸的修飾所造成的有問題的FVII/VIIa構象改變。該專利既未描述也未建議獲得下述FVII/VIIa的方式，所述FVII/VIIa會在非典型性切割位點水平上被修飾，并且其構象應當不受氨基酸序列修飾的影響或受很小的影響。

盡管存在關于經修飾的人FVII/VIIa、特別是在非典型性切割位點水平上經修飾的FVII/VIIa的文件，但是仍然非常需要具有改進的特性的、新的人FVII/VIIa。

發明概述