[發明專利]在奶中產生外源蛋白的轉基因哺乳動物

無效

• 申請號: 200880022856.1
• 申請日: 2008-06-13
• 公開（公告）號: CN101755054A
• 公開（公告）日: 2010-06-23
• 發明（設計）人: A·比爾卡維馳;A·普里恩科;C·梅洛;N·費爾南德茲;N·筑德維克茲;M·克瑞斯庫洛
• 申請（專利權）人: 斯特林貝爾德生物技術北美公司
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02;B01D15/04
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 11038
• 代理人: 李瑛

發明背景

在過去十年中已經由制藥工業通過提取或通過重組技術來普遍地生產人保健中所涉及的蛋白因子和激素。涉及所需基因的遺傳構建體在細菌、酵母或哺乳動物細胞系中成功地得到了表達。然而，使用哺乳動物細胞培養物來獲得復雜蛋白質，如需要適當糖基化模式的那些，涉及高成本的方法。

在過去十年間已經日益增長地使用重組DNA技術來生產商業上重要的生物材料。為此，已經克隆了編碼各種醫學上重要的人蛋白質的DNA序列。這些包括胰島素、纖溶酶原激活劑、α1-抗胰蛋白酶和凝固因子VIII和IX。目前，即使使用新興的重組DNA技術，通常也從血液和組織中純化這些蛋白質，這是昂貴而費時的方法，可能帶有傳播傳感因子如導致AIDS和肝炎的那些的風險。

盡管在細菌中表達DNA序列來生產所需的醫學上重要的蛋白質看起來是有吸引力的提議，但實際上細菌作為宿主常常證明是不能令人滿意的，因為外源蛋白在細菌細胞中不穩定并且沒有被正確地加工。

認識到這個問題，已經嘗試了在哺乳動物組織培養物中表達所克隆的基因并已經在一些情況下證明了是可行的策略。然而，動物細胞的批量發酵是昂貴的且需要技術的過程。

因此存在對用于生產生物物質如正確修飾的真核多肽的高產率，低成本方法的需要。在這種方法中不存在對人具傳染性的因子將是一個優勢。

為了在奶中獲得大量的人蛋白質，獲得所需基因的轉基因動物如牛的可能性已經引起了工業的極大興趣。文獻中的幾個小組報道了他們生產人血清清蛋白、α抗胰蛋白酶的成功以及在轉基因奶牛或山羊中的一些其它實例。

之前已經在小鼠或大鼠中進行了許多實驗，將轉基因表達限制于乳腺中往往是優選的，因為使用β酪蛋白或乳清蛋白啟動子，其只響應哺乳期雌性中的乳腺轉錄因子。

專門在奶中表達異源蛋白意欲避免對宿主哺乳動物健康的不利影響并提供容易的純化方法。

在細菌或細胞培養物中表達異源蛋白可能由于該重組蛋白對宿主哺乳動物的毒性作用而受到阻礙或阻止。在文獻中可以找到許多實例，其中在特定的系統中不能表達某種蛋白，甚至是天然非毒性的蛋白，因為它對宿主是有害的，甚至引起宿主的死亡。死亡的原因可能是細胞內的高濃度蛋白，高濃度的分泌蛋白或與該蛋白的特異性相互作用和在外源宿主中引起細胞病變活性的一些細胞成分。

已經研發了幾種方法來克服這些缺陷，以實現毒性蛋白的異源基因表達，包括使用融合蛋白，修飾原始蛋白序列，分開表達蛋白的不同多肽等。(參見，Protein?Expression?and?Purification(蛋白表達和純化)，2001年8月，22(3)：422-9)。

在轉基因牛中表達重組蛋白時，可以產生相似的作用。在轉基因哺乳動物的產生中，將細胞轉染以獲得攜帶目標外源基因的轉基因克隆，然后將其用于產生轉基因哺乳動物。該方法通常導致該目標序列插入到宿主基因組中，如果使用特異性的啟動子，這是隨后應當導致異源蛋白在靶組織或腺體中的事件，或如果使用通用啟動子，將導致全身表達。蛋白表達的水平將取決于多種因素，包括基因組入發生的位置。

即使當通過組織特異性啟動子指導基因表達時，使用幾種蛋白，在許多不同哺乳動物物種中，已經觀察到外源蛋白滲漏至外周循環系統中(參見Life?Sciences，2006年1月25日；78(9)：1003-9，Epub2005年9月15日；和Journal?of?Biotechnology，2006年7月13日；124(2)：469-72，Epub?2006年5月23日)。根據表達的水平、滲漏的水平、異源蛋白的性質、物種(宿主和外源蛋白)之間的關系和異源蛋白與宿主受體相互作用的能力，這種滲漏可能具有相關的生物學后果。鑒于與宿主同源蛋白的相似性，這些通過轉基因表達的蛋白中的一些可以對外源宿主發揮其天然的生物活性并可以引起能導致哺乳動物死亡的病理作用(參見，Endocrinology1997年7月；138(7)：2849-55)。此外，可能的是：異源蛋白不是通過與相應同源宿主受體的相互作用影響哺乳動物的健康，而是通過當一些異源蛋白在細菌中表達時發生的毒性、非特異性作用影響哺乳動物的健康。

本發明提供了通常與在轉基因哺乳動物中表達對該哺乳動物具有毒性作用的蛋白相關的缺陷的創新性解決方法。

發明概述